[目的]睾氟升高作为一个氟对生殖系统影响的指标已经被广泛接受,我们推测氟可以通过血睾屏障(Blood testis barrier,BTB),然而,对于氟如何突破BTB导致睾氟含量升高,未进行深入研究。因此,本试验在前期氟致雄性动物生殖功能损伤的基础上,选取大鼠睾丸支持细胞为研究对象,通过建立支持细胞BTB体外模型,针对支持细胞BTB的三种细胞连接方式(TJ、GJ、basal ES),检测氟对支持细胞BTB内稳态的影响及相关分子的变化。从而进一步揭示氟的生殖毒性机理,为实施科学诊断和靶标药物设计提供依据。[方法]选取21天左右的SD雄性大鼠,体外建立原代支持细胞BTB模型,模拟BTB体内系统,于不同浓度NaF体外染毒后,采用XTT法检测细胞活性;应用细胞电阻仪测定TER评价紧密连接屏障功能,同时,通过光漂白荧光恢复技术(FRAP)检测缝隙连接通讯功能;采用qRT-PCR、Western Blotting及IF技术,定量分析三种细胞连接相关基因的表达,以及定量定位分析TJ、GJ以及basal ES相关蛋白的表达情况。[结果]1.本实验成功培养了原代支持细胞,利用HE染色,GATA4和WT1免疫荧光技术鉴定所培养的细胞为纯度极高的支持细胞。2.XTT结果显示,与对照组相比,0.01mg/LNaF对支持细胞有极显著的促进作用(P<0.01);20mg/LNaF对支持细胞有非常显著的抑制作用(P<0.001)。说明低浓度的NaF对细胞的活性有促进作用,高浓度的NaF对细胞的活性有抑制作用。3.紧密连接功能和相关基因蛋白的表达情况:TER的测定结果显示,我们成功构建了体外支持细胞血睾屏障模型。支持细胞染氟(0、0.01、1、10mg/L)48后,与对照组相比,0.1mg/L NaF组电阻值显著升高,10mg/L NaF组电阻值极显著降低,表明0.1mg/LNaF使支持细胞紧密连接功能增强,10mg/LNaF使支持细胞紧密连接屏障功能破坏。qRT-PCR结果显示,各处理组CAR的mRNA表达量与对照组相比无统计学意义;与对照组相比,Occludin的mRNA表达量仅在10mg/L处理组出现显著降低(P<0.05);然而1mg/L处理组的ZO-1与对照组相比,mRNA的表达量上升非常显著(P<0.001)。Western-blot结果显示:与对照组相比,0.1mg/L处理组ZO-1蛋白表达量极显著升高(P<0.01);1mg/L处理组Occludin蛋白表达量显著升高(P<0.05),而10mg/L处理组Occludin蛋白表达量呈极显著下降(P<0.01)。IF技术检测Occludin蛋白的定位情况,对照组和0.1 mg/L处理组支持细胞Occludin蛋白主要在细胞膜上表达,而1 mg/L处理组支持细胞Occludin蛋白主要在靠近细胞核的附近表达,且表达量上升,10mg/L处理组支持细胞Occludin蛋白表达量所有降低。4..basalES相关基因和蛋白的表达情况:与对照组相比,N-Cadherin和α-catenin的mRNA表达量仅在10 mg/L处理组出现显著下降(P<0.05),而β-catenin的mRNA表达量在1 mg/L出现显著升高(P<0.05)。Western-blot结果显示,各处理组α-catenin和β-catenin蛋白表达量与对照组相比无统计学意义,1mg/L处理组N-Cadherin蛋白表达量与对照组相比显著上升(P<0.05)。5.缝隙连接功能和相关基因蛋白的表达情况:与对照组相比,各处理组被漂白的支持细胞荧光恢复值均降低,表明缝隙连接功能被破坏。10mg/L处理组的connexin-43与对照组相比,mRNA的表达量显著下降(P<0.05)。Western-blot结果显示,各处理组connexin-43的蛋白表达量与对照组相比显著降低(P<0.01,P<0.001)。[结论]本试验条件下,NaF暴露后基底胞质外特化相关基因和蛋白未改变;1Omg/L NaF暴露后引起紧密连接屏障功能的破坏,同时下调了 Occludin基因和蛋白的表达;各NaF处理组均导致缝隙连接功能障碍,以及主要蛋白connexin-43表达的下降,所以我们推测缝隙连接是氟诱导血睾屏障结构和功能破坏最重要的靶点。