日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)是一种单股正链RNA病毒,可以引起公猪睾丸炎和母猪流产,是一种人畜共患病病毒,蚊子叮咬带毒猪后可将病毒传播给人。JEV主要蛋白有核心蛋白C,膜蛋白PrM/M和囊膜蛋白E,以及(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5)七个非结构蛋白。NS2A基因在翻译过程中会因为核糖体-1移码产生衍生物,与NS1蛋白C端融合,产生NS1’蛋白。JEV致弱株SA14-14-2由于NS2A基因的66位核苷酸由G变为A,无法形成核糖体移码所需的结构,因此失去了产生NS1’的能力。理论上NS1’抗体是JEV野毒感染的特征指标。本研究利用人工合成的纯度为95%的NS1’44aa建立检测猪日本脑炎病毒抗体的间接ELISA方法,并对华东地区2013年的猪群进行血清流行病学调查。同时,根据临床检测数据和实验室动物模型对NS1’多肽的检测对象进行分析,通过基因重组技术获得重组EDⅢ和Cap串联蛋白,利用制备的EDⅢ多克隆抗体和Cap多克隆抗体对串联蛋白进行鉴定。发现其与Cap蛋白存在交叉表位。具体内容如下：1.检测猪血清中日本脑炎病毒移码蛋白抗体的间接ELISA检测方法的建立与应用本研究以人工合成的纯度为95%的NS1’44aa多肽为检测抗原,包被ELISA酶标板,建立间接ELISA抗体检测方法,对各项反应条件进行优化,并确定其临界值,同时进行特异性,敏感性及重复性试验。所建立的ELISA优化条件为：抗原最适包被量为0.5ug/ml,待见血清稀释度为1：100,包被时间为37℃2h后4℃12h,最佳封闭液为1%BSA,一抗作用时间为1.5h,HRP标记的羊抗猪二抗稀释度为1：5000,二抗作用时间为1h,显色时间为10min,临界值为OD450≥0.286判为阳性,OD450nm≤0.238判为阴性,介于二者之间为可疑。与PRV、PRRSV、PCV2、CSFV和FMDV等抗体阳性血清无交叉反应,批间和批内重复性试验较好。根据兽用生物制品试验研究技术指导原则,利用建立的ELISA方法对接种JEV NJ08株的小鼠进行抗体检测,并与实验室已建立的JEV ED III间接ELISA方法进行比对,以验证该方法检测临床动物血清的可行性。利用该方法对华东地区2292份临床猪血清进行了检测,阳性率为73.1%,其中测得母猪血清154份,132份为阳性,阳性率为86.1%,商品猪血清638份,432份为阳性,阳性率为67.8%,为JEV诊断和流行病学调查奠定了良好的基础。因此,检测JEV移码蛋白的间接ELISA存在非特异性反应,JEV多聚蛋白可能存在与NS1’交叉的抗原表位。2.日本脑炎病毒核心蛋白基因与EDⅢ基因串联表达与鉴定经软件分析JEV的Cap蛋白可能与NS1’蛋白存在交叉表位,在尝试不同的载体和宿主菌未能获得全长的Cap蛋白后,将Cap蛋白分段进行表达。PCR扩增JEV的Cap基因的1-81bp和241-347bp,将其分别克隆至pET-32a载体,将鉴定正确的重组质粒命名为pET32a-Cap-a和pET32a-Cap-b,转化到Rosetta感受态细胞中,经IPTG诱导表达后,蛋白以上清形式存在,SDS-PAGE电泳后,将包含C-b蛋白的胶带切下,研磨后用PBS混匀,与人工合成的Capl-27aa混合后免疫新西兰大白兔制备JEV Cap多克隆抗体,对抗体进行IFA鉴定。诱导表达JEV EDⅢ蛋白,将包含目的蛋白的胶带切下,研磨后用PBS混匀,免疫新西兰大白兔制备JEV EDⅢ多克隆抗体,对抗体进行IFA鉴定。采用SOE-PCR方法扩增JEV的EDⅢ和Cap基因,将其克隆至pET-28a载体,将鉴定正确的重组质粒命名为pET28a-EDIII-Cap,转化到Rosseta感受态细胞中,经IPTG诱导后收集菌液进行SDS-PAGE电泳,原核表达产物大小约为29KDa。将诱导表达的EDIII-Cap串联蛋白经梯度尿素洗涤后进行一步法纯化复性,将所得到的复性后的EDIII-Cap蛋白进行Western-blotting分析,表达的蛋白能够与His-Tag单克隆抗体反应,能够与制备的JEV EDⅢ多克隆抗体反应,能够与制备的JEV Cap多克隆抗体反应。综上所述,本研究利用重组EDⅢ蛋白制备了JEV EDⅢ多克隆抗体,利用重组Cap蛋白的C端及人工合成的N端制备了JEV Cap多克隆抗体,制备的EDⅢ-Cap串联蛋白经NI-NTA柱一步法纯化复性后,能够与JEV EDIII多克隆抗体及JEVCap多克隆抗体反应,具备良好的反应原性。3.日本脑炎病毒NS1’蛋白与核心蛋白交叉表位的分析JEV SA14-14-2由于NS2A基因的66位核苷酸由G变为A,无法形成核糖体移码所需的结构,因此失去了产生NS1’的能力,故我们所建立的NS1’间接ELISA方法理应是检测非疫苗免疫即野毒感染所产生的抗体,但根据第一章的数据显示,NS1’间接ELISA与商品化试剂盒的检测结果一致,并没有起到区分疫苗株免疫与野毒感染的作用,而且高达73.1%的阳性率也让我们质疑猪群自然感染日本脑炎的几率,为此,我们选择了JEV SA14-14-2株免疫小鼠,按照不同的时间点采血分离血清,利用实验室建立的EDⅢ间接ELISA和本研究所建立的NS1’间接ELISA对免疫疫苗株的小鼠血清进行检测,结果显示两种ELISA方法检测结果一致,根据以上数据,我们认为NS1’ELISA的检测对象并非野毒感染产生的NS1’抗体,通过生物信息学方法对NS1’的44aa进行比对,发现其与JEV NS5区域存在同源的氨基酸,以NS1’44aa多肽为模板,进行突变,合成了三条新的多肽,命名为NS1’-1,NS1’-2,NS1’-33三条多肽分别含有不同的突变位点,但检测结果显示其与NS1’检测结果一致。利用第二章所表达鉴定的EDⅢ-Cap串联蛋白作为检测抗原,与获得的4株NS1’单抗进行WB反应,结果发现EDⅢ-Cap能够与4D4单抗反应,且产生特异的条带,而对照组EDⅢ蛋白作为检测抗原则不反应,即说明NS1’44aa与JEV Cap蛋白可能存在交叉表位,也解释了第一章中利用NS1’44aa建立的间接ELISA方法的NS1’阳性率偏高的现象。