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目的:在细胞水平上探讨miR-128是否通过PTEN/PI3K/Akt信号通路调控DJ-1蛋白的表达,进而影响Ishikawa子宫内膜癌细胞的增殖、细胞周期、凋亡、侵袭迁移等生物学功能。方法:1.利用Real time RT-PCR技术分别检测正常子宫内膜组织、子宫内膜癌组织、正常子宫内膜细胞系ESC以及子宫内膜癌细胞系Ishikawa中miR-128、PTEN mRNA、DJ-1 mRNA表达情况;同时,利用Western blot技术分别检测上述组织和细胞系中DJ-1、PTEN、磷酸化Akt(p-Akt)的蛋白表达水平;此外,利用统计学方法初步分析子宫内膜癌组织和细胞系中miR-128表达与DJ-1及PTEN表达的相关性。2.miR-128 mimics和miR-128 inhibitor分别转染Ishikawa细胞,并设立相应的阴性对照,转染48 h后,通过Real time RT-PCR检测miR-128表达水平的变化,Western blot检测DJ-1、PTEN、p-Akt蛋白表达水平的变化,以求明确调控Ishikawa细胞内miR-128表达水平是否影响PTEN/PI3K/Akt通路及DJ-1的表达。3.将PTEN siRNA转染或与miR-128 inhibitor共转染Ishikawa细胞,并设立相应的对照组,转染48 h后,通过Real time RT-PCR检测miR-128表达水平的变化,Western Blot检测PTEN、p-Akt、DJ-1蛋白表达水平的变化,以求观察Ishikawa细胞内PTEN沉默是否影响miR-128、p-Akt、DJ-1的表达。同时旨在观察Ishikawa细胞内miR-128抑制对p-Akt及DJ-1表达所产生的影响是否被PTEN沉默所逆转。4.Ishikawa细胞用PI3K/Akt通路抑制剂LY294002预处理24 h,或Ishikawa细胞经miR-128 mimics转染48 h后再用LY294002预处理24 h,随后,通过Real time RT-PCR检测miR-128表达水平的变化,Western Blot检测PTEN、p-Akt、DJ-1蛋白表达水平的变化,旨在观察Ishikawa细胞内PI3K/Akt通路抑制是否影响miR-128、PTEN及DJ-1的表达;同时,观察Ishikawa细胞内miR-128上调对PTEN、p-Akt及DJ-1表达所产生的影响是否被LY294002所逆转,从而进一步明确Ishikawa细胞内miR-128、PTEN/PI3K/Akt通路及DJ-1之间上下游关系。5.将miR-128 mimics转染Ishikawa细胞,同时结合LY294002或DJ-1 siRNA干预,通过对以下指标的检测,明确miR-128经PTEN/PI3K/Akt信号通路调控DJ-1蛋白表达后,是否进一步影响Ishikawa子宫内膜癌细胞生物学功能:(1)CCK-8实验及细胞克隆实验检测细胞增殖的变化;(2)流式细胞术检测细胞周期分布和细胞凋亡情况的变化;(3)细胞划痕实验检测细胞迁移能力的变化;(4)Transwell实验检测细胞侵袭能力的变化。结果:1.与正常子宫内膜组织相比较,子宫内膜癌组织中miR-128、DJ-1 mRNA及蛋白、p-Akt蛋白的表达水平均显著增加,而PTEN mRNA及蛋白表达水平明显下降;同样,与ESC正常子宫内膜细胞系相比,Ishikawa子宫内膜癌细胞系中miR-128、DJ-1 mRNA及蛋白、p-Akt蛋白的表达也均明显上调,而PTEN mRNA及蛋白表达显著下调。有趣的是,通过相关性统计分析发现,子宫内膜癌组织和细胞系中miR-128表达与PTEN表达呈负相关,而与DJ-1表达呈正相关。2.miR-128 mimics转染Ishikawa细胞后,miR-128表达上调,同时伴随PTEN蛋白表达下调,p-Akt及DJ-1蛋白表达上调;相反,miR-128 inhibitor转染Ishikawa细胞后,miR-128表达下调,同时伴随PTEN蛋白表达增加,p-Akt及DJ-1蛋白表达下降。3.PTEN siRNA转染Ishikawa细胞后,PTEN蛋白表达显著下调,而miR-128表达无明显变化,但p-Akt及DJ-1蛋白表达显著上调;此外,miR-128 inhibitor转染上调PTEN蛋白表达及下调p-Akt和DJ-1蛋白的效应均可被PTEN siRNA所抑制,但miR-128 inhibitor转染下调miR-128表达的效应不受PTEN siRNA影响。4.LY294002预处理Ishikawa细胞后,p-Akt及DJ-1蛋白表达显著下调,但miR-128及PTEN表达水平无明显变化;此外,miR-128 mimics转染上调p-Akt和DJ-1蛋白的效应均可被LY294002所抑制,但miR-128 mimics转染上调miR-128表达及下调PTEN蛋白表达的效应均不受LY294002影响。5.miR-128 mimics转染Ishikawa细胞后,可使细胞增殖和克隆形成能力明显增强,同时促使细胞由G期向S期转化,并显著降低细胞凋亡率,增强细胞迁移、侵袭能力。重要的是,miR-128 mimics所产生的上述效应可分别被LY294002和DJ-1 siRNA所抑制。结论:在子宫内膜癌细胞中,miR-128可通过激活PTEN-PI3K/Akt信号通路,上调DJ-1的表达,进而参与调控细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、侵袭和迁移等细胞生物学行为。