研究背景:药物耐药是限制肿瘤的化疗疗效的主要问题。肿瘤可能是在治疗前就对化学药物耐受,而耐药也能通过最初对化疗敏感的肿瘤的治疗过程中获得。这些继发耐药的一个令人沮丧的特征是这些肿瘤不但对最初用于治疗它们的药物耐药,而且对其他不同作用机制的药物产生交叉耐药。耐药,不管是原发还是继发,被认为将对超过90%的转移癌患者治疗失败,而且耐药的微转移肿瘤细胞也可能降低在后续处理中的化疗的作用。显然,如果肿瘤耐药能被克服,那么肿瘤患者存活率的提高将是非常显著的。许多因素将影响化疗药物的敏感性。这些包括限制到达肿瘤的药物数量,影响肿瘤微环境的机制等。肿瘤细胞耐药可以在多个水平发生,包括增加药物排出,减少药物摄入,药物失活,药物靶点的改变,药物造成的损害作用,凋亡的逃逸。脊索瘤比较少见,是具有局部侵袭的骨原发恶性肿瘤,来源于脊索残存物。肿瘤主要发生在中轴骨,好发于颅底区域的蝶骨和骶尾部。脊索瘤通常生长缓慢,低度恶性,对原发肿瘤的控制仍是治疗上的主要挑战。脊索瘤的治疗方法主要依赖于外科手术,手术切除加术后放疗是目前最好的治疗方法。化学治疗对脊索瘤不是主要选择,多因为对化疗药物的细胞毒性抵抗所致,而新近发现的靶向制剂可能提供新的选择。骨肉瘤是一种常见的骨原发恶性肿瘤,其化疗后常有多药耐药现象发生,严重影响患者的治疗效果和预后,因此对其耐药性的检测、耐药机制及逆转的研究一直是众多学者研究的热点。在体外建立多药耐药的细胞模型已逐渐成为研究骨肉瘤多药耐药性的有利工具。紫杉醇作为一种化疗药物,在本中心开展了大量的临床、基础研究并作为骨肉瘤化疗的基础药物,其在临床初始化疗缓解后常会产生耐药性,严重影响患者治疗效果,因此采用紫杉醇诱导建立骨肉瘤多药耐药细胞模型,对探讨骨肉瘤细胞多药耐药机制和耐药逆转治疗具有重要意义。研究目的:探讨多药耐药基因1(MDR1)、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)蛋白、多药耐药相关蛋白(MRP1)在脊索瘤中的表达与脊索瘤病理特征及放化疗抵抗之间的关系。研究脊索瘤CM-319细胞的放化疗敏感性。建立骨肉瘤耐紫杉醇细胞系,探讨骨肉瘤多药耐药的发生机制。研究内容:1、脊索瘤细胞系CM-319的生物学鉴定:通过免疫细胞化学染色、细胞周期分析、透射电镜、糖原染色等分析CM-319的生物学特性。2、脊索瘤细胞系中放化疗相关基因的检测:采用RT-PCR、间接免疫荧光、免疫细胞化学Envision法及western blott法对脊索瘤细胞系CM-319中HIF-1α和MDR1、MRP1基因及蛋白的表达进行检测,探讨HIF-1α和MRP1与脊索瘤化疗耐药、放疗抵抗的关系。3、脊索瘤组织MDR1、HIF-1α和MRP1的表达及临床意义:选取2000年1月至2008年12月接受手术治疗的50例脊索瘤患者的组织石蜡标本,用免疫组化Envision法检测MDR1、HIF-1α、MRP1蛋白的表达情况,并分析其与放化疗抵抗的关系。4、脊索瘤细胞系对放化疗的敏感性研究:通过细胞系体外照射及不同化疗药物对细胞系的敏感性实验,观察脊索瘤细胞系对放疗及化学药物的敏感性。5、人骨肉瘤耐药细胞系MG-63/PTX、SOSP-9607/PTX、OS-9901/PTX的建立及多药耐药机制研究:采用紫杉醇大剂量间断冲击培养法,诱导建立三株紫杉醇耐药骨肉瘤细胞系,并运用MTT法检测6种药物敏感性变化及细胞生长规律变化,流式细胞仪分析亲本细胞系和耐药细胞系的细胞膜表面P-gp蛋白表达率、罗丹明123排出情况,RT-PCR检测细胞内耐药基因的变化,免疫细胞化学检测细胞内P-gp蛋白的表达,western blot法检测细胞内P-gp蛋白的表达。研究结果:1、脊索瘤细胞系CM-319呈上皮样生长,CK、EMA、S-100、Vimentin阳性,富含糖原,染色体为亚三倍体核型,侵袭能力低于骨肉瘤,异种成瘤能力100%。2、脊索瘤细胞系中能检测到HIF-1α及MRP1mRNA的表达,但未检测到MDR1mRNA的表达(P<0.01)。间接免疫荧光染色及免疫细胞化学染色结果提示脊索瘤存在HIF-1α及MRP1的表达。western blot法提示CM-319中存在HIF-1α和MRP1的表达,而不表达MDR1。3、50例脊索瘤组织MDR1的阳性表达率为10%,与髓核的表达(20%)、骨软骨瘤的表达(13.3%)无统计学差异。HIF-1α、MRP1的阳性表达率分别为80%和74%,均明显高于髓核表达的20%、26.7%,骨软骨瘤的表达的20 %和26.7%,具有统计学意义(P<0.01),同时相关性分析显示肿瘤组织中HIF-1α与MRP1两者之间具有正相关性(r=0.8,P<0.01),其两者与MDR1相比呈负相关性。结合临床资料分析,脊索瘤肿瘤组织中MDR1、HIF-1α、MRP1的表达与患者性别、年龄、发病次数相比无统计学意义。4、紫杉醇相对于其他化疗药物对CM-319有较高的抑制率,高浓度紫杉醇与卡铂联合用药对CM-319的抑制有协同作用。紫杉醇作用细胞后电镜下观察到细胞的凋亡现象,细胞周期检测发现细胞阻滞在S期和G2/M期,抑制了细胞的生长。小剂量射线能对紫杉醇起到化疗增敏作用,低浓度紫杉醇能对射线起到放疗增敏作用。5、历时12个月建成人骨肉瘤耐药细胞系MG-63/PTX、SOSP-9607/PTX、OS-9901/PTX能在含PTX 1μg/mL的培养基中稳定生长并传代,其对PTX的耐药指数为69.8、24.4、26.88,并与卡铂、顺铂、表柔比星、氨甲喋呤、阿霉素等多种化疗药物存在不同程度的交叉耐药性;罗丹明排出实验显示耐药细胞内罗丹明含量明显低于亲本细胞;RT-PCR结果显示在耐药细胞系中存在MDR1基因的表达,而在亲本细胞系中无MDR1基因的表达。免疫细胞化学、流式细胞仪及western blot实验均显示在耐药细胞中存在P-gp的表达。研究结论:1、CM-319作为稳定的脊索瘤细胞系,具有上皮组织和间叶组织的特征,性质稳定,为继续研究脊索瘤的放化疗及多药耐药提供基础。CM-319表达肿瘤放化疗抵抗相关的基因HIF-1α和MRP1,而不表达MDR1。脊索瘤组织中同样表达HIF-1α和MRP1,而不表达MDR1。HIF-1α和MRP1的表达呈正相关,与脊索瘤的放化疗抵抗相关。2、CM-319细胞对多种化疗药物不敏感,紫杉醇相对于其他药物有较高的杀伤率,紫杉醇与放射线对脊索瘤的治疗能起到增敏作用。3、MDR1/P-gp在多药耐药的特性上起着至关重要的作用,三株骨肉瘤多药耐药细胞亚系的成功建立为进一步研究骨肉瘤耐药特征及逆转方法打下基础。