肿瘤微环境是肿瘤发生发展必不可少的土壤,肿瘤发展不同阶段逐步建立的免疫抑制微环境,不仅抵抗和抑制机体抗肿瘤免疫应答,而且有助于肿瘤细胞持续扩增,促使免疫细胞失能甚至转变成有利于肿瘤生长的免疫细胞,最终促进了肿瘤细胞生长和肿瘤免疫逃逸。业已表明,一组称之为免疫卡控点的负性共刺激分子异常表达在肿瘤发展不同阶段的组织和细胞,进而介导机体抗肿瘤免疫的抑制,促进肿瘤细胞生长和转移,是构成肿瘤微环境的重要因素。卡控点分子的阻断型抗体或者重组蛋白可调控其信号途径,使肿瘤组织微环境重新获得抗肿瘤免疫力。相关的治疗性抗体在多个临床试验性治疗取得里程碑式进展使阻断免疫卡控点策略受到极大关注,尤其PD-1/B7-H1（PD-L1）和CTLA-4阻断型单抗,因其显示出的卓著疗效已成为治疗性药物上市,用于治疗膀胱癌、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、肾癌、肺癌以及黑色素瘤等癌症。越来越多的临床研究证实,患者用药前检测肿瘤组织对B7-H1（PD-L1）、PD-1的表达并确定表达水平有助于评价卡控点抗体药物疗效和对病人的选择。正在进行的PD-1治疗性抗体的临床研究已将PD-L1作为重要的伴随诊断指标,针对肺癌、恶性黑色素瘤和胃癌的几项临床试验数据结果显示,随着患者PD-L1表达水平的提高,PD-1药物应答率、无进展生存期和中位生存期有明显提高,提示PD-L1伴随诊断在指导肿瘤免疫治疗的抗体用药、提高肿瘤病理检测和预后评估的准确度方面扮演着不可或缺的重要角色,PD-1治疗性单抗以及PD-L1伴随诊断试剂的共同研发是今后免疫卡控点靶向治疗的必然趋势。FDA批准的28种伴随诊断（Companion Diagnostics,CDx）产品中,PD-L1单抗用于定性免疫组织化学分析,检测结果将为肿瘤治疗诊断提供参考。由此表明PD-L1表达水平和临床受益存在一定的相关性,肿瘤患者在接受PD-1单抗药物治疗前有必要进行PD-L1分子的检测。目前国内尚无灵敏度高和特异性好的相关检测试剂。B7-H3和B7-H4在肿瘤组织的表达与微环境中免疫细胞和免疫分子的相关性业已成为肿瘤免疫领域的热点。B7-H3和B7-H4与B7-H1同属负性B7家族成员,在正常外周组织基本不表达,但异常表达在多种恶性肿瘤组织,包括黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌等,表达水平与患者预后和临床转归密切相关,是一个潜在的肿瘤免疫治疗靶标。B7-H3治疗性抗体已在2015年FDA注册进行临床试验,初步结果表明其具有显著的治疗作用。B7-H4治疗性抗体目前处于临床前研发阶段。鉴此,研发B7-H3和B7-H4组织标本检测和伴随诊断试剂将为自主研发B7-H3和B7-H4治疗性抗体奠定厚实的基础。同时,PD-1治疗同种肿瘤疗效的差异还与患者肿瘤组织中肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor-infiltrating Lymphocytes,TIL）的类型相关。在PD-1/PD-L1抗体疗效的相关研究中,根据肿瘤微环境的不同特性将癌症分为四种类型,分别为T1（B7-H1⁺,TIL⁺）,T2（B7-H1^-,TIL^-）,T3（B7-H1⁺,TIL^-）和T4（B7-H1^-,TIL⁺）,在这四种肿瘤分型中,T1型患者响应率最好。因此联合分析免疫卡控点分子B7-H1、B7-H3、B7-H4和CD8⁺TIL具有重要的临床意义。多重免疫组化染色法是一种新型的病理检测技术,可以更为客观地检测、观察和分析不同抗原在原位的表达情况及其伴随的组织状况。多重染色的方法弥补了单一组化染色不利于精确定位被检蛋白的不足,提高了肿瘤标本免疫组化检测的精确度,有助于恶性肿瘤的诊断、确定原发部位和病理分型,提高肿瘤尤其是低分化或未分化肿瘤的诊断准确率。本课题以免疫卡控点B7家族分子PD-1/B7-H1（PD-L1）、B7-H3和B7-H4以及CD8为靶点,研制了系列性单克隆抗体,并在此基础上,通过组织标本（正常和肿瘤）分析与商品化抗体进行比较;建立了PD-1/CD8/Foxp3三分子标记的多重免疫组化方案;选择胃肠道肿瘤组织标本为研究对象,分析胃肠道肿瘤微环境负性B7-H1、B7-H3、B7-H4和CD8表达规律及其临床意义;同时对本单位研制的抗人PD-1阻断型抗体进行工程化和人源化改造,体外实验证实其具有潜在开发价值,为下一步研发B7-H3和B7-H4治疗性抗体奠定相关技术基础。本课题拟解决的科学问题不仅有重要的应用价值,有助于优化现有的肿瘤微环境免疫评价体系,也将为临床制定更为准确的治疗方案提供有价值的伴随诊断试剂和具有潜在治疗价值的阻断型抗体。第一部分特异性抗人B7-H1、B7-H3、B7-H4和CD8单克隆抗体的研制及在免疫组织化学检测的应用【目的】采用杂交瘤技术,研制抗人B7-H1、B7-H3、B7-H4和CD8单克隆抗体并对其特性进行鉴定,继而将上述抗体用于临床病理标本的组化检测,同时引入免疫组化多重染色方案,为肿瘤临床早期诊断和预后评估提供有参考价值的检测抗体。【方法】采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,流式细胞术或ELISA方法筛选杂交瘤细胞培养上清,将检测结果为阳性的杂交瘤细胞株进行反复筛选和多次克隆化培养并对抗体的生物学特性进行鉴定,最终获得抗人B7-H1、B7-H3、B7-H4和CD8单克隆抗体,选取包括扁桃体、脾脏、胚胎来源的肺/胃/肠以及肠癌等正常人组织切片和肿瘤组织作为研究对象,通过免疫组化方法分析B7-H1、B7-H3、B7-H4和CD8在上述组织中蛋白水平的表达特异性和灵敏度。【结果】（1）获得鼠抗人B7-H1单克隆抗体17株、B7-H3单抗26株、B7-H4单抗30株以及CD8单抗8株,免疫荧光标记和流式等检测发现,抗人B7-H1、B7-H3和B7-H4单克隆抗体特异性结合转基因细胞/肿瘤细胞,进一步免疫组织化学鉴定可用于结直肠癌标本特异性染色的B7-H1（克隆号:4C5）、B7-H3（克隆号:4H12）、B7-H4（克隆号:4B2）和CD8单抗（克隆号:3F3,2A2）;（2）免疫组化结果显示B7-H1在扁桃体淋巴滤泡周围及脾脏组织呈阳性表达,B7-H1高表达在胚胎的肺、胃以及肠组织,CD8在扁桃体和脾脏组织呈阳性表达,细胞的胞浆和胞膜均有染色;（3）通过多重免疫组化染色检测PD-1、CD8和Foxp3在扁桃体中的表达,PD-1和CD8定位于细胞膜,Foxp3主要在细胞核表达。【结论】获得能用于病理检测的抗人B7-H1、B7-H3、B7-H4和CD8的单克隆抗体,发掘其在病理诊断、疾病评价和预后评估的应用价值,每种分子选择1-2株研制了相应的免疫组织化学检测抗体;建立免疫组化病理检测的多色组化方案。第二部分B7-H1、B7-H3和B7-H4在胃肠道肿瘤的表达与临床意义【目的】采用第一部分研制的B7-H1、B7-H3、B7-H4和CD8抗体,免疫组化方法检测结直肠癌组织标本,分析结直肠癌不同病理形态中B7-H1、B7-H3、B7-H4和CD8的表达水平和表达规律;分析人胃癌组织中共刺激分子B7-H1、Foxp3和CD8的表达及其表达与胃癌临床病理因素的相关性,从而进一步探讨B7-H1、Foxp3、CD8表达的临床意义。【方法】选择诊断明确、病理资料齐全的人结直肠正常组织、息肉、腺瘤、高级别瘤变及肠癌各30例,免疫组织化学染色方法分析结直肠癌组织中B7-H1、B7-H3、B7-H4和CD8的表达水平和细胞定位;收集临床确诊的267例胃癌组织,免疫组织化学染色方法,分析B7-H1、Foxp3和CD8在肿瘤细胞及微环境免疫细胞的表达,结合患者的临床病理资料,将B7-H1、Foxp3和CD8的表达水平进行统计并分析其表达的临床意义。【结果】（1）采用B7-H1、B7-H3、B7-H4和CD8抗体,免疫组化检测人结直肠癌演进不同阶段病理标本的结果显示,B7-H1在肠癌病人间质细胞的胞浆和细胞核及肠癌细胞的胞膜呈高表达;结直肠腺瘤标本的组化结果显示,B7-H3分子表达水平随着癌变过程的进展逐步上调,B7-H4则仅在结直肠癌组织中高表达,炎症肠组织、腺瘤和高度浸润的结直肠癌组织中存在大量CD8⁺T细胞;（2）研究胃癌组织中B7-H1/Foxp3/CD8的表达水平,浸润CD8⁺T细胞数量低的群体更易发生淋巴结转移（P=0.023）和远处转移（P=0.036）,此外存在远处转移的患者Foxp3表达水平相对更高（P=0.001）,同时B7-H1表达较高的胃癌患者的肿块比低表达组的患者大（P=0.01）,且检测到更多CD8⁺T细胞浸润的患者肿瘤大小偏小（P=0.029）。【结论】结直肠癌组织标本分析显示B7-H1和B7-H3在正常结直肠组织基本不表达,在结直肠腺瘤阶段表达上调,随着病变的发展,其表达水平也逐步增高,B7-H4分子在结直肠癌组织中高表达,在良性病变阶段基本不表达,CD8在正常肠上皮组织基本不表达,腺瘤阶段表达逐步上升,并在高度浸润的结直肠癌组织高表达。上述结果提示B7-H1、B7-H3、B7-H4和CD8分子在结直肠癌发生、发展的不同阶段发挥着不同的作用。B7-H1、Foxp3和CD8在胃癌的表达水平与与患者的肿瘤大小、淋巴结转移和远处转移相关,Foxp3高表达组和CD8低表达组的患者更容易出现多个淋巴结转移,B7-H1与CD8对胃癌患者肿块大小有显著的统计学意义,提示负性分子B7-H1、Foxp3与CD8淋巴细胞相互作用在肿瘤演进中发挥重要作用。第三部分抗人PD-1单克隆抗体的人源化改造及生物学特性的研究【目的】构建抗人PD-1人-鼠嵌合单克隆抗体和人源PD-1抗体,建立工程细胞株表达抗体的平台,探讨PD-1/PD-L1分子在免疫细胞上的表达特性和该负调节通路对人免疫细胞的生物学效应。【方法】在已获得的多株分泌特异性鼠抗人PD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株基础上,采用基因工程手段,PCR获得单克隆抗体的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）序列,与人Fc载体重组为人-鼠嵌合抗体;通过抗体序列库的比对,CDR grafting进一步改造VH和VL,完成PD-1单抗的人源化构建;以Protein G芯片为载体,固定PD-1抗原,流动相为人PD-1抗体,测定抗原/抗体结合与解离时间,计算亲和力;应用获得的人源单抗对人PBMC细胞进行体外生物学功能的研究。【结果】（1）5株PD-1人-鼠嵌合抗体（MHc2.1,MHc3.2,MHc5.1,MHc6.1和MHc7.3）特异性识别L929/PD-1转基因细胞;（2）测定人源化hu5.1,hu7.3与抗原结合/解离度,后者亲和常数达到10^-9,表现出更高的亲和力,两株抗体与商品化人PD-1抗体5C4识别不同的抗原表位;（3）PBMC体外与单抗共培养实验的结果表明,hu7.3抗体可阻断PD-1/PD-L1对活化淋巴细胞增殖的负调节作用,促进淋巴细胞增殖和IFN-γ分泌,且其效应随单抗浓度的增加而趋于增强。【结论】成功构建5株PD-1人-鼠嵌合抗体（MHc2.1,MHc3.2,MHc5.1,MHc6.1和MHc7.3）,其中2株完成人源化改造,研制的PD-1单抗为探讨PD-1/PD-L1抑制途径对免疫细胞的调节作用及其生物学意义提供了必要的物质基础。综上所述,本课题（1）研制了系列抗人B7-H1、B7-H3、B7-H4和CD8单克隆抗体,筛选获得具有灵敏和特异用于免疫组化的单抗,并建立了免疫组化多重染色方法为动态分析上述分子在正常和癌变组织表达部位奠定基础;（2）应用B7-H1联合CD8和Foxp3抗体检测胃癌标本,探讨其对疾病诊断、评估及预后判断的临床价值;采用抗人B7-H1、B7-H3、B7-H4和CD8单抗联合检测,发现B7-H1、B7-H3在结直肠息肉阶段表达上调,B7-H4仅在癌变阶段表达,且表达与浸润免疫细胞相关。（3）研制了抗人PD-1嵌合抗体和人源抗体,建立基因工程真核表达抗体的培养体系,证实人源抗体能较好地结合抗原蛋白,表明其具有阻断PD-1/PD-L1信号,促T细胞活化和增殖的功能。本研究不仅为免疫卡控点治疗提供伴随诊断试剂和潜在的功能性单抗,还通过检测B7-H1、B7-H3、B7-H4和CD8等综合分析人胃肠道肿瘤负性分子和微环境免疫细胞的表达水平与疾病进展的相关性,为肿瘤免疫评价提供多参数指标,有助于阐明肿瘤免疫逃逸的机制。