论文部分内容阅读
新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)感染禽引起的高度接触性传染病。以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征,具有很高的发病率和病死率,对养禽业造成巨大的危害。NDV为单股负链RNA病毒,属于单负链病毒目(Mononegavirales)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、禽副粘病毒属(Avulavirus)。泛素化修饰对于蛋白的亚细胞定位、结构和功能以及降解,都非常重要。有报道表明泛素化修饰帮助副粘病毒M蛋白出核和形成病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP);然而,NDV M蛋白的泛素化修饰以及泛素化修饰在病毒感染周期中的作用尚未得到鉴定。本研究通过共转染和表达NDV Flag-M和HA-Ubiquitin,以免疫沉淀及Western Blot检测,发现M蛋白存在HA-ubiquitin修饰。通过不同副粘病毒M蛋白的序列比对以及在线软件预测分析,推测M蛋白的潜在的泛素化位点为保守赖氨酸K83、K119、K158、K222、K248和K260。通过定点突变,把相应K位点突变为丙氨酸(A)或精氨酸(R),发现K119A、K222A、K248A、K260A、K119R、K222R、K248R、K260R的泛素化条带有所减少,初步鉴定K119、K222、K248和K260具有泛素化修饰。副粘病毒中,NiV、hPIV、SiV以及NDV等的M蛋白可形成VLP,释放到细胞外。有报道表明NiV和人副粘病毒5型的M蛋白的泛素化修饰,对VLP的形成至关重要。本研究中,我们分别表达野生型M蛋白或泛素化位点突变型M蛋白,检测和比较VLP的产量。结果表明,突变K119和K260为A或者R,降低了VLP的形成和释放。由于M蛋白翻译合成后,先进入细胞核,再出核,迁移至细胞膜,完成病毒的组装和出芽释放。NDV M蛋白K119位于副粘病毒保守的NES序列,而K260位于副粘病毒的NLS序列。为了探讨M蛋白泛素化和M蛋白核输出的关系,我们通过间接免疫荧光检测,发现突变体K119R滞留在细胞膜,而K260R滞留在细胞核,因而影响了VLP的形成。进一步检测K119R和K260R蛋白突变体与宿主蛋白的相互作用,发现跟野生型M蛋白相比较,K119R突变导致跟宿主的互作蛋白增多,揭示K119泛素化可能遮盖了蛋白互作位点,使其能顺利从细胞膜释放。综上所述,NDV M蛋白存在泛素化修饰,且K119和K260泛素化修饰有助于VLP的出芽或释放。