竹叶黄酮(AOB)是一类竹子中提取的黄酮类化合物。许多黄酮类化合物具有雌激素效能,可因剂量差异对动物生殖及胚胎发育功能产生不同影响。大熊猫是我国特有珍稀濒危动物,有“国宝”和“活化石”之称,低下的生殖力使大熊猫的种群正在走向灭亡。竹子是大熊猫的主要食物来源,大熊猫的低生殖能力是否会受到竹叶黄酮在体内累积的影响至今尚不清楚。本研究首先采用小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞和小鼠胚胎干细胞(mESC)分化形成的拟胚体(mEB)为模型,探索AOB对小鼠生殖及胚胎发育功能的毒理以及内在相关基因表达的影响及作用机制,以期为进一步探索竹叶黄酮是否对大熊猫生殖力具有影响奠定基础。本研究取得了以下主要结果：1、AOB对MEF细胞的毒理性作用及基因表达的影响采用形态观察、MTT实验、流式细胞术等检测不同浓度AOB对MEF细胞增殖的影响作用。结果表明低浓度AOB (0-10 μg/ml)对MEF生长具有显著促进作用；较高浓度的AOB(≥100μ/ml)对MEF细胞增殖具有显著抑制作用,且能显著增强MEF凋亡率。形态学观察发现,AOB可使贴壁的MEF细胞皱缩,不能维持其梭型状态。实验确定了AOB对MEF细胞的半致死浓度为400μg/ml。根据表达谱基因芯片结果筛选出差异基因792个,其中,实验组与对照组相比表达量上调2倍以上的基因有478个,下调的基因有314个。分析发现,许多差异基因与小鼠生殖功能及胚胎发育等功能密切相关,筛选出与精卵结合、精子发生、精子活力、胚胎发育及生殖细胞发育等生殖功能相关的GO terms 94个。同时KEGG分析发现,许多差异基因参与调控卵母细胞减数分裂、Wnt、MAPK、 P53、Hippo等生殖及胚胎发育功能相关的通路。然后,采用qRT-PCR方法,验证从中筛选的参与细胞凋亡(负调节细胞增殖、细胞凋亡、酮酸代谢过程、代谢过程以及有机酸代谢过程等)功能和生殖调节(精子发生、精卵结合、胚胎发育等)等功能相关GO类和通路中的基因20个(Cxxc4、Fzd1、Sfrp1、Ntrk2、Fgf10、 Kn2、Cpz、Dhrs9、Pla2g4e、Mapk12、Smc3、Lrp6、Cabyr、Pcsk4、Myl2、Pla2g4b、 B23120H23Rik、Rap1a、Pdgfb、Pdgfra)进行了表达检测,qRT-PCR结果表明,各基因的表达趋势与表达谱基因芯片分析结果基本一致。2、AOB影响MEF细胞中ERK和Wnt信号通路的活化程度采用Western blot实验检测AOB处理前后MEF细胞中ERK通路及Wnt信号通路关键蛋白表达量变化,结果发现,磷酸化的ERK和(3-catenin表达量显著上调,说明AOB对两条信号通路具有显著的激活效应。此外,Western blot实验结果显示AOB处理后,生殖相关的蛋白(CABYR, SOX17, P450scc)表达量显著上调。而加入ERK通路和Wnt通路抑制剂后,三种蛋白表达量显著下调,因而推测,AOB通过调控这两条经典通路的激活,影响生殖发育等功能相关蛋白的表达。3、AOB影响mESC分化和mEB的基因表达通过采用ALP染色和Oct4的免疫荧光化学方法鉴定mESC的状态,采用qRT-PCR技术检测处理组和对照组mEB中三胚层标志基因和mES干性标志基因的表达,研究AOB对mEB发育的影响以及预测AOB对胚胎发育的效应。结果表明,50 μg/ml和100μg/ml AOB处理后,其mES干性标志基因Oct4和Nanog的相对表达量较对照组显著增高,推断AOB显著抑制了mESC的分化过程。50μg/ml AOB处理后,mEB原始外胚层基因Gata6表达量显著下调、而Sox7和Pdgfrb表达量则显著上调；外胚层标志基因Nestin和Fgf5表达量显著下调；中胚层标志基因Brachyuary表达量显著下调,而Flk1则显著上调；内胚层标记基因Afp和Sox17表达量显著下调。100 μg/ml的AOB处理后,mEB原始外胚层基因Gata6、Sox7、Pdgfrb表达量显著上调；外胚层标志基因Nestin和Fgf5表达量显著下调；中胚层标志基因Brachyuary表达量显著下调,而Flk1则显著上调；内胚层标记基因Afp和Sox17表达量显著上调。说明AOB显著影响了mESCh和mEB的基因,推测AOB可能影响胚胎的早期发育。表达谱基因芯片分析结果显示,50μg/ml AOB处理后,mEB差异表达基因数明显少于100μg/ml处理组,说明AOB浓度越高,对小鼠生殖功能基因表达的影响越大。根据差异基因GO和KEGG分析的数据,筛选出与小鼠生殖及胚胎发育功能相关的差异基因,并进行qRT-PCR验证,结果与芯片检测结果一致。认为AOB影响小鼠生殖能力及胚胎发育是复杂的过程,可能是通过调控与小鼠生殖及胚胎后期发育、孕酮合成关键酶等功能相关基因表达而实现的。此外,AOB可显著影响生殖发育功能相关的Wnt及MAPK等信号通路的关键调控基因差异表达,影响通路信号传导,从而影响小鼠的生殖及胚胎发育功能。与对照相比,两种浓度AOB处理后的mEB中miRNA-294/295/372/373的靶基因Fgf10, miRNA-449abc/34ab的靶基因Pdgfra表达均显著上调。推测AOB对小鼠生殖及胚胎发育功能的影响作用也可能与miRNA调控相关。4、AOB影响mEB细胞中ERK和Wnt信号通路的活化程度Western blot实验检测AOB处理前后mEB细胞中ERK通路及Wnt信号通路关键蛋白表达量变化,结果发现,磷酸化的ERK和P-catenin表达量显著上调,说明AOB对两条信号通路具有显著的激活效应。此外,Western blot实验结果显示100μg/ml AOB处理后,生殖相关的蛋白(CABYR, SOX17, P450scc)表达量显著上调。而加入ERK通路和Wnt通路抑制剂后,三种蛋白表达量显著下调,进一步证明,AOB通过调控这两条经典通路的活化,影响生殖发育等功能相关蛋白的表达。5、AOB影响差异表达基因的生物学效应为了进一步探索AOB对小鼠生殖及胚胎发育功能影响作用机制,生物信息学预测芯片试验中与小鼠生殖及胚胎发育功能相关差异基因在调节信号传导网络中的作用,以及连接这些信号的上下游调控基因节点,进一步探索AOB影响小鼠生殖及胚胎发育功能的机制。通过IPA分析差异基因所导致的下游生物学效应,即疾病和功能分析,结果显示AOB作用后产生的差异表达基因主要在多种肿瘤、神经系统症状、骨骼肌病等相关疾病中富集。信号通路分析发现,差异表达基因主要在MAPK、Wnt、p53和PI3K/AKT等信号途径中富集。总之,通过MEF和mEB细胞模型研究,发现特定浓度的AOB对动物的胚胎发育和胚胎生殖具有明显的毒性作用。也为进一步探索大熊猫生殖力降低的原因和机理提供一种思路。