糖胺聚糖是一类由重复二糖结构单元组成的线性长链大分子多糖,包括肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸和硫酸角质素等。糖胺聚糖来源丰富、结构多样,具有多种生物活性和药理作用,在医药领域应用广泛。糖胺聚糖的结构复杂、分离困难,要获得完全单一种类的糖胺聚糖十分困难。不同结构糖胺聚糖的药理作用不同,肝素钠事件的发生使得各国对糖胺聚糖的分析测定尤为重视,因此建立一种快速、准确的糖胺聚糖分离测定方法对其相关产品的质量控制十分重要。硫酸软骨素在骨关节炎的治疗领域有着广泛的应用,但不同来源硫酸软骨素的结构存在微小差别,这一差别可导致其活性的差异。因此,建立一种快速鉴别硫酸软骨素来源的方法意义重大。糖胺聚糖是一种内源性的生物大分子,人体内糖胺聚糖的浓度水平和健康状况密切相关。目前糖胺聚糖已作为保健品和药品口服或注射使用,但其给药后在体内的存在方式仍存在争议,糖胺聚糖的药代动力学参数多是通过测定其二糖含量获得的,并不能体现糖胺聚糖分子在体内的浓度水平,因此建立一种血浆中糖胺聚糖的分析测定方法对疾病诊断、治疗药物监测和糖胺聚糖的药代动力学研究有重要意义。目前,关于糖胺聚糖的分离测定多采用化学降解或酶降解的方法,对降解后产生的单糖或多糖进行分析,操作繁琐复杂,且不能准确反映出体内未降解糖胺聚糖分子的浓度水平。因此,本研究致力于建立快速、准确的糖胺聚糖的分析方法,具体研究内容如下。1.本文在前人的工作基础上建立了一种采用金纳米棒作为假固定相的分离硫酸软骨素和硫酸皮肤素的毛细管电泳法。实验考察了不同种类的缓冲溶液,最终选取了乙二胺-磷酸缓冲溶液。实验还考察了缓冲液pH、浓度、分离电压和不同大小、形态的纳米金材料对硫酸软骨素和硫酸皮肤素分离的影响,结果表明不同种类和粒径的纳米金材料对分离的影响不同。优化后的电泳条件为：分离体系为含30%(v/v)金纳米棒和20 mmol/L磷酸二氢钠的150 mmol/L乙二胺-磷酸缓冲溶液(pH 4.5),分离电压为-10 kV,采用内径50 μm、有效长度为49 cm、总长度为59.2 cm的熔融石英毛细管,柱温为25℃,紫外检测器的检测波长为200 nm。所建方法成功应用于硫酸软骨素和硫酸皮肤素的分离,硫酸软骨素和硫酸皮肤素的迁移时间和峰面积的RSD值分别为0.13%、0.14%和0.86%、1.07%。2.本文采用Materials studio软件对纳米金和柠檬酸钠、葡糖醛酸的相互作用进行分子动力学模拟,待体系稳定后计算相互作用能和扩散系数,结果表明葡糖醛酸和纳米金的相互作用能大于柠檬酸,葡糖醛酸的扩散系数大于柠檬酸钠,在葡糖醛酸和柠檬酸钠的竞争性吸附中,葡糖醛酸占优势,这与文献中所得出结论一致,证明了该方法适用于糖和纳米金的相互作用研究。3.本文建立了一种鉴别硫酸软骨素来源的毛细管电泳微调控法,依据不同来源硫酸软骨素降解后产生二糖种类及比例的不同可对其来源进行鉴别。实验考察了分离缓冲溶液种类、底物浓度和孵育时间对分离和测定的影响,优化后的电泳条件为：毛细管为内径50 μm、有效长度为50 cm、总长度为60.2 cm的熔融石英毛细管,柱温为37℃,紫外检测器的检测波长为232 nm。分离缓冲液为25mmol/L硼酸盐缓冲液(pH 9.5),孵育缓冲液为50 mmol/L Tris-60 mmol/L醋酸钠缓冲溶液(pH 8.0),孵育缓冲溶液、硫酸软骨素溶液、硫酸软骨素ABC酶溶液及孵育缓冲溶液依次进样,其中孵育缓冲溶液于0.5 psi下进样10 s、硫酸软骨素溶液和硫酸软骨素ABC酶溶液于0.5 psi下进样5s,在-1 kV/+1 kV/-1 kV/+1kV各加压6s使酶和底物充分混合,于+1.0 kV电压、孵育8 min后,在毛细管两端加+20 kV电压分离酶和产物,其中硫酸软骨素浓度为500 μg/mL。在优化条件下,硫酸软骨素二糖的分离度较好。所建方法用于不同来源硫酸软骨素中二糖的含量的测定,将测定结果与离线方法进行对比,结果表明所建方法可用于不同来源硫酸软骨素的鉴别。4.本文建立了同时分离透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素和肝素的毛细管电泳法。实验考察了不同种类的分离缓冲溶液,最终发现二亚乙基三胺-磷酸缓冲体系的分离效果较好。实验不仅考察了缓冲液pH、浓度、分离电压和毛细管内径对分离度的影响,实验还考察了磷酸二氢钠浓度对分离的影响。确定的最终电泳条件为：缓冲溶液为80 mmol/L二亚乙基三胺-磷酸缓冲溶液(pH 5.0),毛细管为熔融石英管,内径为50μm,总长度为60.2 cm,有效长度为50 cm。检测波长为200 nm,电泳温度为37℃,样品存放温度4℃,分离电压为-24 kV,采用压力上样,样品于0.5 psi下进样10 s。实验对透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素的含量测定进行了方法学确证,结果表明所建方法可用于三者的含量测定并成功应用于混合多糖样品中透明质酸、硫酸软骨素和硫酸皮肤素的含量测定。5.本文采用优化后的分离条件,建立了同时测定人血浆中透明质酸和硫酸软骨素含量的毛细管电泳法。实验考察了多种不同提取方式,最终选用4 mol/L NaCl、氯仿和乙醇处理血浆；实验还考察了血浆体积对检测灵敏度的影响,最终选取200μL血浆；最后考察了溶血对测定的影响,结果表明溶血血浆会影响硫酸软骨素的测定。实验对所建方法进行了方法学确证,其中透明质酸的线性范围为50 μg/mL至600 μg/mL,硫酸软骨素的线性范围为500 μg/mL至6000 μg/mL,精密度和准确度均符合要求。