背景和目的在当今社会,恶性肿瘤已成为一种常见病和多发病,对人类的健康危害很大,恶性肿瘤的预防和治疗也是众多学者们非常关心的问题。恶性肿瘤的治疗经历了一个漫长的过程。其治疗方法有外科手术治疗,内科化疗及分子靶向治疗等。外科手术从广泛的切除治疗,到组织和功能的保存治疗,已经发展到当前的微创治疗、个体化治疗；内科治疗主要从化疗即全身用药细胞毒药物治疗,应用化疗药物杀死肿瘤细胞,延缓病情进展,发展到目前根据不同分子靶点的靶向治疗、自体或异体生物治疗等；放射治疗取得了很大进步,如靶向性放疗局部放疗及联合应用放化疗及分子靶向治疗的综合治疗,进一步提高生存期,减低药物的不良反应。但是目前恶性肿瘤的治疗仍然面临很多问题,需要我们去认识和研究,比如恶性肿瘤的耐药问题,如何提高患者的生存率及生存质量以及肿瘤晚期的临终关怀等。并且很多肿瘤发现时已是晚期的病例也很多,恶性肿瘤三级预防的意识有待进一步提高。乳腺癌是女性最常见的的恶性肿瘤之一,现行的治疗方法也很多,目前多为临床医生采用的方法为联合手术,放化疗以及内分泌和靶向治疗的综合冶疗近年来,其治疗手段也取得了很大的发展,外科治疗从传统的乳腺癌根治术发展到保乳手术,乳房重建及前哨淋巴结活检等；放射治疗也取得了很大进步,随着放疗设备的更新,放疗技术的提高及放疗理念的变化,放射治疗的效果也取得了很大的提高。比如用靶向性放疗代替局部淋巴结放疗,提高了治疗效果且减少了其副作用；乳腺癌化学治疗方法的研究及成果更是日新月异,传统乳腺癌的基本化疗药物有蒽环类、紫杉类,如今一些抗代谢药物如卡培他滨、吉西他滨,还有植物碱类如长春瑞滨等,很多大型的临床研究中已经确认了他们对乳腺癌治疗的效果和安全性,这些药物如今在临床上已经得到了普遍的应用[1]。内分泌治疗药物也不断更新,性激素类药物从基本的三苯氧胺发展到氟维司群,以及第三代芳香化酶抑制剂如来曲唑,阿那曲唑的出现,均为雌激素阳性乳腺癌的治疗提供很多选择。更为可喜的是分子靶向药物曲妥珠单抗的出现,为HER-2阳性的乳腺癌患者带来了福音。但是,乳腺癌的治疗仍面临着很多问题,比如三阴性乳腺癌由于缺乏特异的靶向治疗,预后通常较差,并且晚期乳腺癌患者对常用化疗药物耐药者日益增多,因此对于晚期乳腺癌寻找更为有效的化疗药物及方案很有必要。本文就乳腺癌的内科治疗,主要是化疗药对晚期复发转移乳腺癌的治疗做了进一步的研究。选用替吉奥胶囊及依托泊苷注射液两种药物联合应用,观察其对体外乳腺癌细胞MC-F7的抑制作用,为晚期复发转移乳腺癌的临床治疗提供依据。方法1细胞培养MCF-7细胞应用配制好的含胎牛血清的RPMI-1640培养基培养,培养于为37℃、5%CO2的恒温培养箱中。根据情况24h-48h换液,48h-72h传代。2细胞生长抑制率的测定选用对数生长期MCF-7细胞,稀释至5×104/ml并接种于96孔板,同时设置空白对照(单用培养液)和实验组(加药组),后置于37℃、5%C02培养箱中常规培养48h,采用噻唑蓝(MTT)还原法来检测细胞的生长抑制率。实验重复3次(n=18)。3细胞形态学观察利用用倒置显微镜观察药物作用于MCF-7细胞48小时后的形态学的变化。4应用流式细胞仪检测药物作用后MCF-7细胞凋亡率5Wstern blot应用Western blot检测不同浓度药物作用于MCF-7细胞后,BCL-2蛋白的表达情况。6统计学分析采用统计学软件SPSS17.0分析,均数采用x±S表示,均数之间的比较采用t检验,以α=0.05为检验水准。结果1对MC-F7细胞的生长抑制作用1.1依托泊苷对MCF-7细胞的生长抑制作用用培养液稀释后的一系列不同浓度依托泊苷(0.5p.mol／L、1.0μmol／L、5.0μmol／L、10.0μmol/L,20.O μmol／L,40.0μmol/L,100.0μmol/L)作用于乳腺癌MCF-7细胞后,其抑制率分别为7.63％,15.05%,27.99%,38.35%,48.51%,58.25%,64.28%。1.2替吉奥对MC-F7细胞的生长抑制作用用培养液稀释后的一系列不同浓度替吉奥(0.5μmol／L.1.0μmol／L、5.Oμmol／L、10.0μmol／L,20.0μmol／L,40.0μmol／L,100.0μmol,L)作用于乳腺癌MC-F7细胞后,抑制率可达到10.63%,23.56%,26.00%,41.91%,57.55%,65.74%,71.36%。1.3替吉奥联合依托泊苷对MC-F7细胞的生长抑制作用根据MTT结果选择两药联合作用时(替吉奥lμmol／L+依托泊苷1μmol/L、替吉奥lμmol／L+依托泊苷10μmol／L.替吉奥5μmol／L+依托泊苷5μmol/L.替吉奥5μmol／L+依托泊苷10μmol／L),不同浓度药物作用后对MC-F7细胞的抑制率可分别为25.58%,57.44%,78.72%,87.08%。2药物作用后MCF-7细胞形态学变化空白对照组：MCF-7细胞贴壁生长,呈多边形或长梭形,细胞间结构紧密,细胞生长旺盛,折光性好。替吉奥组(5μg／ml):部分细胞相互分离,细胞变为圆形,体积缩小,贴壁能力减弱,失去了正常形态,细胞间接触变松,折光性较差。依托泊苷组(10μg／ml):部分细胞相互分离,细胞变为圆形,体积缩小,贴壁能力减弱,失去了正常形态,细胞间接触变松,折光性较差。两药联和组(替吉奥5μg／ml+依托泊苷10μg／ml):大量细胞互相分离,细胞体积缩小,变圆并浮起,细胞膜变得皱缩,胞内颗粒增多深染且固缩,可见细胞碎片,细胞死亡。3体外培养的MCF-7细胞经过单药分别作用和及两药联合作用后,流式细胞仪检测结果显示：联合用药组与空白对照组相比较其凋亡率有所升高；不同浓度两药联合组随联合用药浓度增加,凋亡率逐渐上升。4Western blot检测结果显示,随着药物浓度增加,bcl-2蛋白灰度与内参灰度值的比值,即Bcl.2／β-actin逐渐减小。即随着药物浓度增加,bcl-2蛋白的表达降低。采用两独立样本的t检验加药组与对照组比较的bcl-2的表达,可见替吉奥单药与空白对照组、依托泊苷单药与空白对照组、联合用药组与空白对照组相比较,在α=0.05的检验水准下,差异均有统计学意义。结论1替吉奥和依托泊苷均能明显抑制乳腺癌MCF-7细胞的生长活性；两药联合应用时,对乳腺癌MCF-7细胞生长活性的抑制作用更为明显。2替吉奥和依托泊苷单药及两药联合应用时,均可诱导细胞凋亡。3实验结果显示,替吉奥、依托泊苷单用及组合应用时均对体外乳腺癌MCF-7细胞有抑制作用,机制可能为作用于细胞周期诱导细胞凋亡及bcl-2蛋白表达水平下降有关。本实验为两种化疗药物的动物体内实验及后续的临床实验中提供依据。