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肺癌的发病率较高,非小细胞肺癌(NSCLC)占了肺癌总数的85%左右。晚期肺癌患者或发生脑转移的患者预后较差。在本实验中我们主要涉及到的样本来自非小细胞肺癌患者,除此之外引入了脑转移患者样本。利用Meta分析和全基因组相关联分析,有研究者筛选出ZCCHC14的缺失可能是引起尼古丁成依赖(ND)的易感性和酒精成瘾性的原因,并且分析识别与卒中相关的新的遗传变异中,发现ZCCHC14与小血管卒中可能存在相关性,所以不排除ZCCHC14在肺癌发生发展过程中与脑血管形成和管理(management)过程中发挥作用。ZCCHC14在癌组织中的表达及作用尚未有研究。本研究中,我们首先研究ZCCHC14在人体肺癌组织和脑转移病灶中的表达及意义。关于CCHC型蛋白在肿瘤中的研究较少,仅有的几篇研究文章表明CCHC型锌指蛋白在肿瘤组织中多参与调控MAPK信号通路发挥生物学功能,ZCCHC14也隶属于CCHC型锌指蛋白且关于其可能参与的信号通路并没有研究。所以在接下来的研究中我们将对ZCCHC14是否调节了MAPK信号通路进行初步证实,并在MAPK信号通路的哪一个亚家族进行调节的相关机制进行筛选,这也是接下来实验中的重点。在证实过程中引入进入国家临床三期试验的抑制剂Doramapimod(BIRB796),进一步验证ZCCHC14在非小细胞肺癌发生进展中的功能及分子机制。目的:探究ZCCHC14在非小细胞肺癌及脑转移患者中的表达和意义,以及其在NSCLC细胞增殖与侵袭过程中的作用及机制。研究方法:通过免疫组化实验检测癌旁肺组织和NSCLC癌组织中ZCCHC14的表达;利用SPSS软件分析ZCCHC14的表达与肺癌临床病理因素之间的相关性;结合肺癌患者样本数据分析ZCCHC14与肺癌患者预后的关系;通过免疫组化实验检测患者脑转移病灶组织中ZCCHC14的表达;利用SPSS软件分析ZCCHC14的表达与NSCLC患者脑转移之间的相关性;利用UALCAN数据库检索ZCCHC14在肺癌常见类型肺鳞癌和肺腺癌中启动子甲基化水平;通过免疫荧光实验检测ZCCHC14在肺癌细胞中的定位;利用免疫印记实验检测ZCCHC14在肺癌细胞中的蛋白表达;利用免疫印记实验检测转染ZCCHC14及ZCCHC14-KO质粒后,MAPK信号通路各亚家族及下游相关分子蛋白的表达情况;通过transwell和集落形成实验检测转染ZCCHC14及ZCCHC14-KO质粒后细胞增殖和侵袭能力的改变;在转染ZCCHC14-KO质粒和未转染ZCCHC14-KO质粒的肺癌细胞中添加抑制剂后,利用transwell和集落形成实验检测ZCCHC14表达水平的改变对细胞增殖和侵袭能力的影响;在转染ZCCHC14-KO质粒和未转染ZCCHC14-KO质粒的肺癌细胞中添加MAPK-P38信号通路抑制剂后,利用免疫印迹实验检测ZCCHC14在调控MAPK-P38通路过程中的影响,以及检测P38信号通路下游效应因子MMP7、Cyclin D1的表达水平,进一步探究ZCCHC14在肺癌进展中的作用机制;利用小鼠荷瘤实验检测ZCCHC14对小鼠成瘤能力的影响。结果:1、ZCCHC14在NSCLC患者癌旁肺组织中的细胞核和细胞质中均有表达,在NSCLC患者肺癌组织中表达减弱或缺失。2、ZCCHC14在癌组织中的异常表达与分化程度、TNM分期及性别显著相关(P<0.05)。3、生存曲线显示在癌组织中ZCCHC14低表达的患者生存时间明显短于ZCCHC14高表达的患者生存时间(P=0.023)。KM Plotter数据库显示,ZCCHC14 m RNA高表达的NSCLC患者生存率高于ZCCHC14 m RNA低表达的NSCLC患者生存率(P<0.001)。4、NSCLC脑转移患者中ZCCHC14的低表达率明显高于在没有脑转移患者的癌组织中检测ZCCHC14的低表达率,差异具有统计学意义(P<0.05)。5、ZCCHC14在肺鳞癌和肺腺癌中启动子甲基化水平显著增高(P<0.001)。6、ZCCHC14在HBE和肺癌细胞中均有表达,在LK2、H460和H292细胞中有不同程度的降低。免疫荧光染色实验显示,ZCCHC14在癌细胞的胞核和胞浆中均有表达。7、Transwell实验和集落形成实验结果表明下调ZCCHC14的表达后,癌细胞的侵袭和增殖能力显著提高。8、在A549和H1299细胞中转染ZCCHC14-KO质粒后,p-P38和P38分子通路下游信号分子Cyclin D1和MMP7显著升高。P38的表达量没有明显改变。9、在LK2细胞中转染ZCCHC14过表达质粒后,p-P38表达下降,细胞增殖及侵袭能力下降。10、集落形成实验和transwell实验结果表明,在A549和H1299细胞中添加P38信号通路抑制剂BIRB796后可以消除添加ZCCHC14-KO质粒对细胞增殖和侵袭作用的影响。11、Western blot结果表明转染ZCCHC14-KO质粒促进P38通路及通路相关下游分子的变化被抑制剂BIRB796所废除。12、ZCCHC14可以调节p-PI3K蛋白表达。13、体内实验表明ZCCHC14可以引起小鼠成瘤能力的改变。结论:1、ZCCHC14在NSCLC癌组织中低表达;2、ZCCHC14的低表达与肺癌患者的性别、分化程度、TNM分期、不良预后及脑转移密切相关;3、ZCCHC14能抑制肺癌细胞的增殖和侵袭;4、ZCCHC14通过MAPK-P38信号通路调控肺癌细胞的增殖和侵袭。5、ZCCHC14通过调控PI3K的磷酸化影响P38信号通路。6、ZCCHC14可以调节小鼠成瘤的能力。