背景强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一种慢性炎症性自身免疫性疾病,在某些病人中,其病变最终会引起骶髂关节、脊柱及外周关节(尤其是髋关节)的骨化强直,导致患者活动功能丧失,严重影响生活质量。中医学认为先天禀赋不足、肝肾亏虚、督脉失养是AS发病的根本原因,感受外邪,侵袭经脉为病标。AS的病理过程主要包括两个阶段：炎症反应阶段和附着点异位成骨阶段。病理性成骨是AS患者致残的主要原因,抑制或延缓骨化是AS治疗的关键。长久以来,对AS的研究主要在集中在炎症和免疫领域,对骨化进行研究的易感基因相对较少。目前大多数学者认为AS的炎症与骨化并不一定直接关联,但两者之间存在着某种间接的联系,其潜在机制至今仍未完全明确。众多研究表明Wnt信号通路在骨形成中起着重要的作用,是参与软骨内骨化的最重要信号通路。Wnt/β-catenin信号转导通路是其中的经典途径。Wnt蛋白对于常规的骨代谢非常重要,特别是在以成骨细胞导致的新骨形成方式途径中扮演了重要角色。Wnt通路的这种效应可以通过阻断Dickkopf-1(DKK-1)蛋白(Wnt拮抗剂)表现出来。DKK-1是DKK家族中研究最为广泛的Wnt信号通路天然抑制因子,其可以明显抑制Wnt信号传导通路的激活,以此阻止成骨活动。研究表明Wnt信号通路在AS的发展(异位骨化)中其到了十分重要的作用,尤其是DKK-1在AS发病的重要性越来越受到关注,是参与AS病理过程的一个关键调控因子,在动物关节炎模型中是调节成骨代谢发挥重要作用。有研究已发现功能性DKK-1水平在AS患者血清中表达降低,但其与影像学进展是否相关联,在AS患者组织中是否表达下调,目前还没有确切的研究。前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE-2)是最为重要的炎症介质之一,在体内广泛参与各种炎症过程以及骨形成或吸收的合成/分解代谢过程,在成骨细胞中PGE-2的含量是所有前列腺素中最高的。PGE-2可以通过诱导成骨细胞分化进行骨重塑,并在异位骨化中起到了重要的调节作用。目前关于PGE-2在AS中的研究较少。AS患者GWAS研究发现PGE-2的其中一种受体PGER4,和AS患者的进展相关。PGE-2亦可以通过一系列反应激活Wnt经典通路并抑制DKK-1的表达。目前对于AS炎症的靶点因子研究主要集中于肿瘤坏死因子a(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α),然而最近研究发现虽然TNF-是AS发病中的关键作用环节,但是阻断TNF-似乎并不能延缓AS的放射学进展,这表明TNF-a可能并不是连接炎症和骨转化的桥梁因子。目前西医治疗AS的药物大致分为非甾体抗炎药(Non-steroidal antiinflammatory drugs,NSAIDs)，慢作用风湿性药物(Disease-modifying anti-rheumatic drugs,DMARDs)和生物制剂TNF-a拮抗剂三类。NSAIDs是AS的一线治疗药物,多项研究证明其可以抑制AS患者的病理性骨化作用,这一现象表明PGE-2有可能是炎症和骨形成之间的连接介质。但由于NSAIDs有潜在的胃肠道和心血管等不良反应,限制了其临床长期应用。DMARDs对于AS的治疗效果尚未得到公认,因为研究表明其并不能阻止疾病活动和影像学进展。而生物制剂TNF-a拮抗剂临床应用较为广泛,能改善许多AS患者的临床症状,控制系统炎症反应的程度。然而近年来临床实际应用却发现在预期安全剂量治疗下的副作用逐渐增多,短期或长期使用均会产生严重不良反应,而且也有权威研究发现TNF-α拮抗剂不能在远期控制AS患者的影像学进展.这就使得研究者急需寻找连接AS炎症和骨化相关的基因或蛋白作为干预靶点,并开发新的药物对此进行干预。中医药在长期治疗AS的实践中,积累了大量的经验和有效方药,治疗方法多样,疗效肯定,具有独特的优势。而明确传统中医药中的药物活性成分和分子治疗靶点是现代中医药发展的重要研究方向。目前国内外较多的文献报道了应用雷公藤多甙治疗AS的良好效果,(其中雷公藤红素又称南蛇藤素,它是雷公藤多甙片的最重要的有效成分之一,是一种从雷公藤分离的具有多种生物活性的天然产物。雷公藤红素具有很强的抗氧化和抗类风湿作用,并且有抗癌症新生血管生成的作用。目前国内外关于雷公藤红素是否可以抑制AS病理性骨化未有相关研究。有研究报道低浓度的雷公藤红素可以抑制由脂多糖诱导的PGE-2的生成,其机制被认为是下调了COX-1和COX-2的水平,这为雷公藤红素抑制PGE-2诱导的成骨提供了重要的理论依据。本研究以AS患者的血清、髋关节囊组织以及体外原代培养的AS患者髋关节囊滑膜成纤维细胞作为研究对象,利用ELISA、Western blot、实时定量PCR、流式细胞术以及慢病毒转染等现代分子生物学技术为研究方法。首先我们探讨了DKK-1水平在AS患者与健康人群对照组之间的差异以及功能性DKK-1与AS患者影像学进展的相关性。然后以调控成纤维细胞向成骨型分化的Wnt/β-catenin信号转导通路为切入点,通过检测Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白及DKK-1在AS患者组织和成纤维细胞中的表达情况,继而运用慢病毒转染技术,探讨基因过表达和基因沉默DKK-1后,AS患者Wnt/β-catenin信号转导通路相关蛋白的情况和成纤维细胞增殖以及向成骨细胞分化转换的能力,最后以此为理论依据观察雷公藤红素是否能够通过PGE-2与Wnt/β-catenin信号转导通路及其抑制因子DKK-1的交互作用抑制AS患者成纤维细胞的增殖以及向成骨型细胞分化,延缓AS成纤维细胞的骨化进展,从分子信号转导层面探讨雷公藤红素治疗AS、发挥抗骨化作用的可能机制。目的1.1本研究将探讨AS患者与健康对照组血清DKK-1水平的差异,并研究血清总DKK-1水平和功能性DKK-1水平是否与AS患者的影像学进展相关联。1.2探讨DKK-1以及相关Wnt通路蛋白以及成骨因子在AS患者和股骨颈骨折患者髋关节囊组织以及分离的成纤维细胞中的表达差异,并采用流式细胞术分析两组成纤维细胞的生长率,生长周期和凋亡率。1.3运用慢病毒转染技术探讨DKK-1基因过表达或者DKK-1基因沉默是否影响了AS患者髋关节囊滑膜成纤维细胞的细胞增殖能力和成骨能力。1.4探讨雷公藤红素是否可以抑制PGE-2诱导AS患者分离的成纤维细胞的增殖和骨化倾向,并且探讨这一效应雷公藤红素的是否是因为PGE-2以及Wnt通路的交互而起作用,为后续动物实验、药理实验和其临床应用提供依据。方法2.1选择来自我院诊断为AS的患者62例,所有患者诊断均符合1984年修订后的纽约标准,有感染性疾病、其它炎症性关节炎、损伤以及先天性结构功能异常的患者被排除在本次研究之外。此外60例在年龄和性别上相匹配的正常健康人作为对照组。收集所有AS患者者的骨盆和全脊柱正位片,影像学评估采用1984年修订后的纽约诊断中的骶髂关节炎影像学分级标准和改良斯托克强直性脊柱炎评分(mSASSS)中的影像学诊断,纽约标准中的影像学分期至少在Ⅱ级以上。从所有受试者中收集静脉血,离心并立即储存至-80℃。功能性DKK-1(与受体LRP6的结合形式)采用功能性ELISA;全血DKK-1水平采用双抗夹心ELISA法,计算组内和组间变异系数,控制变异度。所有数据经SPSS 18.0统计软件包进行统计学分析,所测得数据以均数±标准差(mean士SD)或者中位数(最小值-最大值)表示。AS患者与健康对照组血清总DKK-1水平采用两独立样本t检验,功能性DKK-1水平采用Mann-Whitney U检验；AS患者不同纽约影像学分级之间功能性DKK-1水平的两两比较采用Mann-Whitney U检验；AS患者功能性DKK-1水平与纽约影像学分级以及mSASSS评分之间的相关性采用Spearman相关性检验,以P<0.05视为有统计学差异。2.2选择在我院因AS髋关节强直接收全髋关节置换手术患者的髋关节囊滑膜标本6例,年龄在25-45岁之间。此外取得因外伤致股骨颈骨折需行手术治疗的男性患者的髋关节囊滑膜组织6例,年龄在25-45岁之间。在无菌手术中,用锐刀切除患者髋关节囊组织若干小块,将部分放有冰袋的保温桶内保存,取回至实验室后置于液氮中保存用于检测基因和蛋白表达；将另一部分立即放置于含有20%的青霉素钠,硫酸链霉素和10%胎牛血清的DMEM培养液中,并于放有冰袋的保温桶内保存,并迅速转入细胞培养间进行原代培养,进行下一步实验。实验组和正常组髋关节囊滑膜组织DKK-1的表达测量分别采用Western Blot, RT-PCR和免疫组化技术,利用流式细胞术检测实验组和股骨颈骨折对照组细胞增殖率,细胞周期,总细胞凋亡率；并采用细胞免疫荧光检测两组成纤维细胞DKK-1的表达情况。结果应用SPSS 18.0统计软件包进行统计学分析,所得数据以均数±标准差(mean ± SD)表示,结果分析采用两独立样本t检验,以P<0.05视为有统计学差异。2.3收集第3代呈对数增长的AS成纤维细胞,在慢病毒转染的前一天,收集细胞置于6孔板中,每孔1×105单位细胞。培养好的AS患者髋关节囊成纤维细胞用编码DKK-1基因的plvx-DKK-1, DKK-1 shRNA或者空病毒载体进行转染, 转染后使用经典成骨诱导液进行诱导。转染后采用MTS[(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)2-(4-sulfophenyl)-2H-t etrazolium]细胞增殖检测法和EdU细胞染色法(5-ethynyl-2’-deoxyuridine)检测各组细胞的增殖情况,第10天后采用Western Blot分别检测通路蛋白β-cantenin, p-β-cantenin, DKK-1, c-myc, cyclin D1和成骨相关蛋白Runt-related transcription factor 2 (Runx-2),骨钙素(Osteocalcin,OCN),碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)的表达情况,并采用茜素红进行钙结节沉积染色的检测。所得结果应用SPSS 18.0统计软件包进行统计学分析,实验数据以均数±标准差(mean ± SD)表示,结果分析采用单因素方差分析,多重比较采用LSD-T检验。以P<0.05视为有统计学差异。2.4将前面培养的AS成纤维细胞,用PGE-2进行增殖和成骨诱导。在培养的第12天分别在每组中加入分别加入既定剂量的DMSO,吲哚美辛和雷公藤红素分为6组培养,分为AS成纤维细胞正常细胞组、AS成纤维细胞+DMSO(阴性对照组)、AS成纤维细胞+吲哚美辛1.0μM(阳性对照组)、AS成纤维细胞+雷公藤红素小剂量(0.5μM)、AS成纤维细胞+雷公藤红素中等剂量(1.0μM)、雷公藤红素高剂量组(2.0μM)。观察时间为。第12,14、17、20天分别检测各组的细胞计数,计算各组细胞的增殖率；在第14天检测各组细胞EdU染色阳性细胞的情况；在第14天、21天和第28天检测各组细胞碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, ALP)活动、茜素红染色情况以及实时荧光定量PCR检测成骨因子Runt-related transcription factor 2 (Runx-2)、骨钙素(Osteocalcin,OCN)、Ⅰ型胶原蛋白(Type Collagen Ⅰ),骨形成蛋白2(Bone morphogenetic protein 2,BMP-2)的mRNA表达情况；在第14天、21天和第28天应用Western Blot免疫印迹实验检测蛋白PGE-2、AKT、PI3K、GSK-3β、DKK-1、SOST、β-cantenin的表达。结果应用SPSS 18.0统计软件包进行统计学分析,实验数据以均数±标准差(mean 士SD)表示,采用单因素方差对各组数据进行分析,多重比较采用Scheffe检验法,以P<0.05视为有统计学差异。结果3.1AS患者和正常对照组之间血清总DKK-1水平在两组之间无显著性差异。AS患者血清功能性DKK-1水平显著低于正常对照组。AS患者血清功能性DKK-1水平与修订的纽约标准影像学分级和改良斯托克强直性脊柱炎得分呈显著负相关。3.2 Western Blot, RT-PCR,免疫组化和细胞免疫荧光分析显示DKK-1水平在AS患者髋关节囊滑膜组织和分离培养的成纤维细胞中的表达要显著低于对照组(股骨颈骨折患者)。流式细胞分析显示AS患者髋关节囊滑膜成纤维细胞呈现了更快的增殖速度,生长率和较低的调亡率。3.3基因沉默DKK-1降低磷酸化β-catenin的水平,升高β-catenin,c-Myc,cyclin D1和成骨因子Runx-2,ALP和OCN的水平。过表达DKK-1则引起的相反的效应,抑制了Wnt/β-catenin通路和成骨因子的表达。DKK-1基因沉默后钙结节茜素红染色表达增强,而过表达DKK-1钙结节茜素红染色表达减弱。3.4霞公藤红素在体外实验中明显抑制了AS患者髋关节囊滑膜成纤维细胞的增殖和骨化,并且这一效应呈时间梯度和浓度梯度。Western blot分析研究表明PGE-2,AKT,PI3K的表达随时间显著降低,而GSK-3p表达随时间显著上升,而β-catenin的表达随时间显著降低。在另一方面,Wnt通路抑制蛋白DKK-1和SOST的表达则随着时间显著升高。结论4.1血清功能性DKK-1水平与强直性脊柱炎患者影像学进展呈负相关。血清功能性DKK-1可能可以作为反应强直性脊柱炎影像学进展的血清标志物。4.2 DKK-1在AS患者髋关节滑膜组织以及原代培养的成纤维细胞中表达要显著低于股骨颈骨折对照组。AS成纤维细胞增殖和调亡之间的不平衡关系亦有可能参与促进了成骨。4.3 DKK-1表达的变化可以影响强直性脊柱炎患者滑膜成纤维细胞增殖和成骨分化的能力,表达其在强直性病理性的骨化中可能起到重要的作用。4.4雷公藤红素可以抑制PGE-2诱导的强直性脊柱炎成纤维细胞增殖和骨化。PGE-2,Wnt/β-catenin通路及其抑制因子DKK-1与PI3K/AKT通路及它们之间的相互作用可能参与了这一过程。将来需要更进一步的药代动力实验,动物实验和体内研究证明雷公藤红素可以抑制强直性脊柱炎患者异位骨化的能力。