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生物催化和转化技术因其高效性、多样性、底物专一性、区域选择性、化学选择性、对映选择性以及温和的反应条件等特点,被誉为继医药生物技术和农业生物技术之后的“第三次生物技术浪潮”。本文采用微生物转化技术进行新农药的创制。选择了高效,对温血动物低毒的烟碱类杀虫剂吡虫啉(imidaeloprid,IMI)为底物,从自然界和菌种库中筛选可转化IMI的菌株,采用静息细胞转化法羟基化IMI,获得了一种IMI羟基化的转化产物5-羟基吡虫啉(5-hydroxy IMI),5-hydroxy IMI经酸、热水解可得到文献报道的杀虫活性提高10-16倍的烯式毗虫啉(olefin IMI)。
以IMI为唯一氮源进行富集培养,从土壤中筛选到了7株可将IMI转化为一种极性更大的化合物的菌株。其中一株命名为NJl的菌株具有较高的转化IMI的能力,转化样品经HPLC/MS分析,证明该极性更大的转化产物为IMI的羟基化衍生物。采用BioMerieux Vitek自动微生物分析仪鉴定,NJl菌株被鉴定为Stenotrophomonasmaltophilia;16S rDNA结果分析进一步证明了NJl菌株与在系统发育地位上属于S. maltophilia。从菌种库中筛选结果表明,与NJl菌株属于同一个种的S.maltophiliaCGMCC 1.1788菌株的转化能力高于NJl菌株。S.maltophilia CGMCCl.1788被选为进一步研究用菌种。
S.maltophilia CGMCC 1.1788菌株发酵条件研究结果表明,培养温度介于20至35℃之间,羟基化酶活性几乎没有变化,而最适生长温度为30℃;最高羟基化酶活性出现在对数生长期中期之后;苹果酸和麦芽糖为最适生长碳源,琥珀酸和乙酸钠为羟基化酶活性碳源,乙酸钠为最适比酶活力碳源;牛肉膏为最适生长氮源,酵母膏和玉米浆分别为最适羟基化酶活性和比酶活力氮源;各种吡啶类化合物和咪唑烷类化合物作为诱导剂添加到培养基中,测试结果表明酶形成不需要诱导剂诱导。
5.hydroxy IMI合成条件研究结果表明,酶活性受通气量影响较大,摇瓶装液量越少,酶活性越大,摇瓶转速越高,转化活力越高;最适转化温度为25℃;在转化液中添加蔗糖、葡萄糖和苹果酸等促进剂可显著提高酶活性,添加5%(w/v)蔗糖的转活性较对照组提高了近9倍;最适羟基化酶活性pH为6.5;底物最适浓度为0.01%。
采用5L发酵罐进行S.maltophilia CGMCC 1.1788的发酵和转化研究,实验结果表明,转化70h后,转化液中转化产物的含量可达到260rag/L转化液。采用二氯甲烷萃取两次后,约97%的未转化的底物被去除,93%的产物仍保留在水相中;含有转化产物的水相部分再用等体积的乙酸乙酯萃取,87%的产物可被萃取到乙酸乙酯相中。萃取液经浓缩,有机相膜过滤,结晶后,可得到纯度为98%的产物晶体。晶体经质谱、元素分析、核磁共振光谱和单晶体x一射线衍射法分析,确认其结构为5.hydroxy IMI,且羟基所在的碳原子具有顺式构。
采用酸热水解法将5-hydroxy IMI转变成olefin IMI实验结果表明,0.1M盐酸、80℃加热25 min后,5-hydroxy IMI可完全被水解;酸热水解产物经HPLC/MS和NMR分析确认为olefin IMI。5-hydroxy IMI转变为olefin IMI的摩尔转变系数为86.97%。生物活性测试结果表明,olefin IMI和5-hydroxy IMI均有杀蚕豆蚜活性。经以IMI为对照,三者的杀虫活性排序为olefin IMI>IMI>5-hydroxy IMI。相对毒力指数测定表明,olefin IMI对蚕豆蚜成虫的活性是IMI的19倍,是蚕豆蚜若蚜的2.25倍,olefin IMI对褐飞虱成虫的活性是IMI的1.43倍,但对褐飞虱若虫的活性只有IMI的0.5倍。盆栽试验验证了室内生物活性结果,并证明olefin IMI对蚕豆苗安全。
综上所述,本论文采用微生物转化法获得了5-hydroxy IMI,5-hydroxy IMI经酸水解后得到了对蚜虫成虫生物活性高于IMI 19倍的olefin IMI。并首次证明了一些纯培养微生物如细菌,真菌可将IMI羟基化生成5-hydroxy IMI。5-maltophiliaCGMCC 1.1788静息细胞催化IMI羟基化发生在IMI咪唑烷环上的5位碳原子(IMl分子C12位)上,并具有顺式构型。在转化液中添加蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和苹果酸等促进剂可显著提高转化酶的活性。