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近年来,噬菌体裂解酶已广泛用于生物控制中代替抗生素,并且它们在人类,动物和其他养殖动物的传染病的预防和治疗中起重要作用。裂解酶通常都在原核的大肠杆菌系统中表达,但存在产量低、不稳定、可溶性差以及细胞毒性高等缺点。因此,本研究旨在构建出高效安全的酵母表达系统以生产获得广谱嵌合裂解酶ClyV,为实现临床应用进一步奠定基础。本研究将扩增得到的ClyV基因,经双酶切后与酵母表达载体pPIC3.5k和pPIC9k相连接得到了pPIC3.5k-ClyV和pPIC9k-ClyV,采用电转化导入毕赤酵母中,并通过遗传霉素抗性平板筛选得到了阳性酵母多拷贝菌株。利用甲醇对上述得到的毕赤酵母pPIC3.5k-ClyV和pPIC9k-ClyV工程菌进行诱导发酵,而后经镍柱亲和层析法纯化得到了裂解酶ClyVp1和ClyVp2。同时对本实验室保藏的大肠杆菌BL21/pET 28a-ClyV工程菌也进行原核胞内诱导表达,并经镍柱亲和层析纯化得到了裂解酶ClyVe。ClyV裂解酶在大肠杆菌和毕赤酵母中均实现了正确表达,就ClyV的表达量和溶解度来看酵母系统相对更佳为了进一步比较毕赤酵母来源的ClyVp与大肠杆菌来源的ClyVe之间的酶学性质差别,定量测定了在PBS缓冲液中ClyV的杀菌活性以及在不同温度、pH、EDTA和NaCl条件下的稳定性,结果表明大肠杆菌和毕赤酵母来源的ClyV对无乳链球菌S12均有较高的裂解活性,100μg/mL能在60 min内使S12降低约3个数量级;酵母ClyVp在45℃活性稍高于大肠杆菌ClyVe;ClyVp、ClyVe的最适pH分别为6.0和9.0;ClyVp比ClyVe的裂菌活性更为稳定,即使在1000 mM NaCl浓度下仍约有40%活性,在800μM EDTA浓度约保留有60%活性。通过MTT测定法测试了ClyV对仓鼠卵巢细胞CHO-K1的细胞毒性作用,结果表明,将500μg/mL的ClyVe与CHO-K1细胞共同孵育24 h后即可检测出一定的细胞毒性,而酵母ClyVp即使在2000μg/mL时毒性仍然很小。综合来看,较之于大肠杆菌ClyVe,酵母ClyVp有着更多的优点,在工业生产和生物医疗方面有着更好的应用潜力。