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水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)在玉米上引起粗缩病,在水稻上引起水稻黑条矮缩病,给我国玉米和水稻生产造成了严重危害。
本研究从山东省、江苏省和安徽省等地区采集到表现典型症状的玉米粗缩病和水稻黑条矮缩病样品。通过RT-PCR获得103个RBSDV分离物S10片段的cDNA克隆,测定其序列。扩增的S10片段长1801 bp,其中5’-UTR为21 bp,3-UTR为103 bp,中间1677 bp编码558个氨基酸的衣壳蛋白(CP)。
通过序列分析发现这103个RBSDV分离物衣壳蛋白基因(cp)的核苷酸一致率为94.7%~100%,与国内其它地区分离物的核苷酸一致率为94.5%~100%。与日本分离物(D00606)的核苷酸一致率最低,为78.7~81.9%。山东、江苏和浙江的四个分离物(SDJNiR15、Ly-m2、JSSQS8和Zhejiang)有明显的重组。在系统进化树中,这些分离物可以分为两个组(Ⅰ组和Ⅱ组),其中Ⅰ组含有99个分离物,Ⅱ组含有18个分离物,这两个组分别分为2个亚组(ⅠA亚组、ⅠB亚组和ⅡA亚组、ⅡB亚组)。RBSDV分离物的聚类结果与地理和寄主来源没有相关性。来自不同地区或寄主的RBSDV种群均处于负向或者纯化选择。核苷酸序列错配分布分析表明,RBSDV在江苏、山东和安徽等地区呈现长期存在且处于一种平衡状态。基因流分析结果表明,RBSDV在山东、江苏及安徽等地区间及玉米和水稻等寄主间进行的基因交流非常频繁。
根据RBSDVcp基因序列设计了四对检测引物,通过比较不同的Mg2+浓度、Taq聚合酶用量、退火温度、样品稀释倍数等得到最佳检测体系为:10x PCR缓冲液2.5μL,25 mmol/L MgCl21.5μL,dNTP(每种2.5 mmol/L)2.0μL,10μmol/L上游和下游PCR引物(F4和R4)各1.0μL,Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL,模板DNA5.0μL,加灭菌的重蒸水至25μL,第四对检测引物(F4:5’-AGYGAAGAATTTGTAGGTGTG-3’;R4:5’-GTTTCAACAAATGACGCTAC-3’)灵敏度最高,不仅可以从单头灰飞虱中检测到病毒,还可以在玉米样品总RNA稀释10000倍(相当于1.673 ng的植物总RNA)时仍可以从中检测到病毒。利用上述体系和引物,检测了小麦、灰飞虱及42种杂草的带毒情况。结果在小麦(Triticum aestivum L.),灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallen)及6种禾本科杂草中检测到RBSDV。另外首次在菊科的苣荬菜(Sonchus brachyotus)、醴肠(Eclipta prostrata)、泥胡菜(Hemistepta lyrata)、小蓟(Cephalanoplos segetum)和苋科的反枝苋(Amaranthus retroflexus)中也检测到了RBSDV。