佛波酯(12-O-tetradecanoylphorbol-1,3-acetate,TPA)作为一种有效的细胞外调节者,不仅调控细胞生长,还影响细胞凋亡。例如,一方面,作为肿瘤刺激因子,TPA能够和EB病毒共同诱导裸鼠发生癌变；另一方面,作为凋亡诱导剂,TPA也能够诱导如鼻咽癌CNE2细胞和小脑颗粒细胞肿瘤凋亡。因此,TPA根据不同的细胞类型发挥不同作用。本项研究中我们用TPA处理胃癌细胞MGC80-3和BGC-823,结果发现TPA作为凋亡诱导剂诱导胃癌细胞凋亡。　　 磷酯酶C(PLC)在哺乳类胚胎期和成年期的各种细胞中广泛存在,分为三种亚型:PLC-β,PLC-γ及PLC-δ。许多细胞外信号分子如激素、肽类生长因子和免疫球蛋白等都可以通过结合细胞表面受体,活化PLC引发细胞内反应。活化的PLC能够水解磷脂酰肌醇4,5-双磷酸(PIP2),产生甘油二酯(DAG)和肌醇3磷酸(IP3)。DAG是蛋白激酶C的生理性激活剂,而IP3可以刺激钙离子从细胞内钙库中释放。这两种信号途径构成了PLC调节作用的关键,进而调节众多细胞活动,例如细胞生长、分化和细胞凋亡等。　　 蛋白激酶C(PKC)是磷脂依赖的、存在于胞浆内的丝氨酸/苏氨酸激酶,参与细胞内的信号传导。PKC是一个同功酶家族,生长因子、激素和神经递质刺激细胞能够激活PKC和诱导其磷酸化。PKC同功酶可以分为三类:传统型(a,β1,BⅡ,γ)、新型(δ,ε,η,θ,μ)和非传统型(ξ,λ/τ)。由于细胞类型和同功酶种类不同,PKC的各种同功酶通过参与不同的信号通路(如Erk、JNK和NF-kB等)而调节细胞多种生物学功能,包括细胞凋亡、分化和生长的调节。　　 蛋白激酶B(PKB,也称为Akt)作为蛋白激酶C的同源激酶,在肿瘤细胞中高水平的表达。外界因子刺激下,PKB通过磷酯酰肌醇3-激酶(PI3K)途径导致其Thr308和Ser473位点磷酸化而被激活。PKB与不同的生长刺激途径如PDGF、VEGF以及细胞存活相关信号包括BAD、Forkhead、p53等相互交叉联系,从而成为抑制细胞凋亡,促进细胞生长等生命调控过程的关键调节者。　　 尽管目前对PLC、PKC和PIKB三种蛋白在细胞凋亡和生长过程中的生物学功能有了部分了解,但是它们在TPA诱导胃癌细胞凋亡中所发挥的确切作用和信号传导途径尚不清楚。为此,在这篇论文中,我们首先运用细胞分子生物学方法探讨PLC-γ2和PKCα的作用及其相关性,提出了两者蛋白相互作用的新模型。进一步,我们分析TPA对PKB的调节作用,发现TPA可以通过泛素-蛋白酶体途径降解PKB。我们还探讨了PKB和PKCα的相互关系,提出了PKCα介导TPA降解PKB的可能机制。同时,我们在人胃腺癌标本中验证了PKB和PKCα的相互关系。因此,我们的研究结果有助于深入理解TPA调控胃癌细胞的作用机制,为肿瘤临床治疗提供新的理论基础。　　 本论文由两部分组成,包括:一,PLC-γ2和PKCα在TPA诱导细胞凋亡中的相关性；二,PKCα在TPA诱导PKB磷酸化和降解中的调节作用。　　 在第一部分工作中,我们研究了PLC-γ2和PKCα在TPA诱导细胞凋亡中的关系。首先发现在胃癌细胞中TPA不仅能够上调 PLC-γ2的表达,也能够诱导PLC-γ2从胞浆转运到细胞核。然而,这个过程和细胞凋亡没有直接关联。另一方面,我们还发现尽管TPA不能上调 PKCα,但是能够诱导PKCα从胞浆转运到细胞核。为了进一步探讨PKCα调节PLC-γ2机制,我们分别用PLC抑制剂U73122和PKCα抑制剂 Protein kinase C inhibitor peptide(PIP)处理胃癌细胞,结果表明PLC-γ2能够接受TPA信号,并将信号传递给 PKCα,通过 PKCα的介导而诱导胃癌细胞凋亡。因此,通过研究我们认为,PLC-γ2是TPA和PKCα之间 cross-talk的关键传递者,而PKCα是细胞凋亡的关键效应者。PLC-γ2和PKCα的转运是TPA诱导胃癌细胞凋亡的关键步骤。　　 总之,第一部分研究工作的创新点是:(1)TPA能够提高PLC-γ2的蛋白表达水平,但这个过程并不直接参与胃癌细胞凋亡的诱导。(2)TPA能够诱导PLC-γ2从胞浆转运到细胞核。(3)PLC-γ2和PKCα转运是TPA诱导胃癌细胞凋亡的关键。　　 在第二部分工作中,我们探讨了PKCα在TPA诱导PKB磷酸化和降解中的调节作用以及PKCα与胃癌细胞生长抑制之间的关系。我们发现TPA能够通过泛素一蛋白酶体途径降解PKB蛋白和抑制 Ser473位点的磷酸化作用。正是由于TPA诱导的PKB降解导致细胞DNA合成率下降,从而抑制胃癌细胞生长。进一步分析PKB和PKCα的相互关系时,我们发现PKCα能够直接下调PKB及其Ser473位点的磷酸化水平,而且TPA诱导PKCα入核是其抑制核PKB蛋白水平和磷酸化的必要条件,因为PKCα从细胞浆转运到核后能够通过与PKB相互作用降解PKB,而PKCα专一抑制剂G(o)6976能够部分阻断TPA对PKB的降解。由此,我们提出了PKCα介导TPA诱导PKB蛋白磷酸化和降解的可能模式:TPA诱导PKCα由胞浆转运到细胞核,通过与核PKB相互作用,抑制PKB表达及其Ser473位点的磷酸化,从而降低细胞DNA合成,抑制胃癌细胞生长。PKCα与PKB的相互作用模式在人胃腺癌标本中得到进一步的验证。免疫组化分析表明,在人胃腺癌组织中,PKB和PKCα均有表达,其中PKB表达水平与肿瘤恶性程度正相关(a=0.05,P<0.01),而PKCα表达与肿瘤恶化程度不相关(a=0.05,P>0.05)。PKCα与PKB蛋白表达则存在负相关性(X2=5.85,P<0.05:r=-0.650 P<0.01)。　　 总之,第二部分研究的创新点是:(1)发现TPA通过泛素.蛋白酶体途径降解PKB蛋白和抑制PKB的Ser473位点磷酸化。(2)提出PKCα在细胞核通过与PKB相互作用而降解 PKB,导致胃癌细胞生长的抑制。(3)PKCα与PKB的相互作用与PKB磷酸化无关。(4)胃癌细胞中PKCα与PKB的相反作用在人胃腺癌标本中得到进一步佐证。