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目的:1、克隆人Tim-3基因胞外段序列,构建人可溶性Tim-3(s Tim-3)的重组质粒表达载体pET28a-sTim-3-EGFP。2、重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,并对其表达条件进行优化,以获得较多可溶性的EGFP-sTim-3融合蛋白。方法:按照Trizol试剂说明书(Invitrogen)取健康人外周血单个核细胞提取总RNA,按照逆转录试剂说明书(Takara)构建人Tim-3基因的cDNA文库。根据Genebank中Tim-3序列结合跨膜预测软件设计Tim-3胞外段上下游引物,RT-PCR扩增Tim-3基因的胞外段片段sTim-3。产物与pMD18-T载体(Takara)连接转化感受态大肠杆菌DH5α,氨苄西林(Amp)筛选阳性克隆,进行菌液PCR、提取质粒双酶切鉴定,后选取阳性克隆菌液送公司测序。对阳性菌株所提质粒及已构建好的原核表达载体pET28a-EGFP质粒进行相同内切酶双酶切和琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段,将纯化回收的sTim-3片段和EGFP-pET28a片段连接构建pET28a-sTim-3-EGFP重组质粒。将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α进行卡那霉素(kan)抗性筛选,挑取单菌落培养,经PCR、双酶切及测序鉴定阳性克隆。提取鉴定阳性的重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),挑取单克隆菌株培养进行PCR和双酶切验证。荧光显微镜下确定荧光较强的单菌落培养菌液行IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色和Western blot检测以验证目的蛋白。通过调整IPTG浓度、诱导时机、诱导温度与诱导时间优化蛋白表达条件。结果:1、应用RT-PCR技术,从人外周血单个核细胞总RNA中扩增得到约620 bp的Tim-3基因的胞外段,与载体pET28a–EGFP连接,对重组体进行的菌液PCR、双酶切验证和测序分析结果表明:成功构建了原核表达载体pET28a-sTim-3-EGFP。2、重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。诱导前后荧光显微镜的对比观察显示诱导后绿色荧光明显增强,SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色以及采用His标签单抗和EGFP标签单抗进行的Western blot检测验证了约为50.0 KDa的sTim-3-EGFP融合蛋白的表达。3、蛋白表达条件优化的SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色结果显示一定范围内的IPTG浓度对蛋白表达量没有影响;温度对蛋白表达量影响不大;在培养至OD600值约为0.6~0.8时于25℃诱导5 h可获得较高的蛋白表达。结论:成功构建高效表达可溶性Tim-3的原核表达载体pET28a-sTim-3-EGFP,表达的重组蛋白sTim-3-EGFP大小和预期相符,且为可溶性表达,为该蛋白的进一步纯化生产、应用及sTim-3的功能研究奠定良好基础。