肿瘤是严重危害人类健康和生命的疾病之一，死亡率高居各病之首，全世界每年因恶性肿瘤死亡的病人达500万以上，已经成为当今威胁人类健康的主要敌人。肿瘤细胞的耐药性和转移是目前影响肿瘤治疗效果的两大因素，获得性耐药在所在肿瘤患者中的比例高达30％。Folkman首先提出肿瘤的生长和转移需要新生血管参与这一概念。随着血管生成在肿瘤发生过程中的作用及机制研究的不断深入，许多学者提出抗肿瘤血管生成治疗可能是抗肿瘤的一种新的手段。肿瘤是血管依赖性病变，几乎所有恶性肿瘤的侵袭性生长都伴随着广泛的新生血管生成，抗血管生成治疗不必考虑肿瘤细胞类型及异质性，只要阻断肿瘤血管生成，就能达到抑制肿瘤生长之目的。大量研究证实新血管的形成、发展取决于血管生成生长因子和血管生成抑制因子之间的平衡。而肿瘤血管生成是一个多步骤、多种因子参与的复杂调控过程，不同阶段发挥作用的调控因素不同；肿瘤内血管丰富，血管生成处于不同阶段。近年来抗血管生成治疗在理论和临床研究方面都取得了迅猛的发展，部分药物已显示出良好的发展前景。但要充分发挥抗血管生成治疗的作用，还必须依赖于对肿瘤血管生成发生发展的分子机制的真正全面的了解。Ang-2是新近发现的一种参与调节血管形成的蛋白质分子，其调节血管形成的作用引起人们的重视。关于这方面的研究，国外报道较少，采用Ang-2影响肿瘤血管形成的研究国外已经开始，国内尚未见报道。在本实验中，我们构建了人Ang-2基因真核表达载体并转染不表达该基因的人宫颈癌Hela细胞，并观察在裸鼠体内Ang-2基因对肿瘤血管形成的影响。 本实验首先从人胎盘组织提取总RNA，采用RT-PCR反应获得Ang-2的完整编码序列，并经过酶切鉴定和序列分析证实。然后将Ang-2的cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3上，应用脂质体转染技术将该真核表达载体稳定转染人Hela细胞。提取细胞蛋白用SDS-PAGE和WesternBlot检测Ang-2蛋白的表达。稳定转染Ang-2的细胞注射Balb/c裸鼠皮下(细胞数量为5×106/只)，另外设pcDNA3空白质粒对照组、Hela空白对照组和Hanks组。4周后处死所有组的裸鼠，测量瘤结节大小，瘤结节固定、石蜡切片免疫组化分析蛋白表达和肿瘤微血管计数。 本实验获得Ang-2的完整编码序列，经过核苷酸序列分析，成功地构建了含有1491bp的人Ang-2基因真核表达载体；转染Hela细胞提取细胞蛋白经过SDS-PAGE和WesternBlot分析，在70kDa处可见阳性条带；不同组别的Hela细胞种植在Balb/c裸小鼠的皮下，Ang-2实验组和对照组裸小鼠均存活并在皮下种植的局部形成瘤结节，移植成瘤率达到100％；Ang-2组出现肉眼可见的皮下的瘤结节的时间为9.57天，明显迟于pcDNA3空白质粒组和Hela细胞组，差异性显著，而pcDNA3空白质粒组和Hela细胞组之间未见明显差异；Ang-2组的肿瘤体积明显小于pcDNA3空白质粒组和Hela细胞组，差异明显，pcDNA3空白质粒组和Hela细胞组之间相互比较未见明显差异；从绘制的肿瘤体积变化曲线可以观察到，pcDNA3空白质粒组和Hela细胞组肿瘤体积增长快，当肿瘤体积增长到500mm3后增长的最为显著，Ang-2组与前两组相比曲线相对平缓，未见明显的增长期；采用第Ⅷ因子相关抗原染色对肿瘤微血管进行计数，Ang-2组MVD平均值为12个/HP，而pcDNA3空白质粒组和Hela细胞组明显多于Ang-2组，组间差异明显。 本课题的主要攻关、研究特色及创新之处：本实验在国内首次成功构建Ang-2真核表达载体；本实验首次成功的将携带有Ang-2基因序列的真核表达质粒转染Hela细胞，首次成功建立人宫颈癌Hela细胞-Ang-2稳定转染细胞系，并成功表达Ang-2蛋白；为进一步研究Ang-2基因在肿瘤血管生成中的作用奠定了基础；本实验首次将稳定转染人Ang-2基因的Hela种植在裸鼠皮下并成功地建立了皮下移植瘤模型，研究认为Ang-2作为血管生成调节因子在肿瘤血管形成的早期可以抑制肿瘤血管的形成，进而抑制肿瘤的生长，为肿瘤血管源性治疗提供了新的途径。 本研究得出以下结论： 1、皮下种植性瘤成瘤时间上Ang-2组明显迟于pcDNA3空白质粒组和Hela细胞组。 2、通过对种植性肿瘤体积的连续观察结果表明，Ang-2基因明显抑制人宫颈癌种植瘤的生长。 3、通过对种植肿瘤组织MVD的分析，Ang-2基因降低肿瘤血管形成的数量，进而达到抑制种植性肿瘤的生长。