表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)是寄居于人体皮肤表面常见的一种条件致病菌,通常并不致病。然而,随着各种人工医疗材料(如人工瓣膜、静脉留置管和导尿管等)的普遍使用,表皮葡萄球菌已成为引起医院内感染主要致病菌之一。表皮葡萄球菌能在医疗植入材料表面形成生物被膜(Biofilm)样结构,而该结构具有抵抗抗生素治疗和宿主免疫系统的作用,从而导致耐药株产生及慢性感染。细菌能够生存的首要前提是适应外界环境,因此细菌必须具有感应外界环境信号的能力,并迅速将信号传入菌体内,从而启动一系列相关基因的转录、表达以及表达产物的修饰,发挥相应的生物学功能。大多原核生物利用双组分信号转导系统(Two-component Signal Transduction Systems,TCSs)的机制进行信号转导,调控其生物学特性。TCSs由组氨酸激酶(Histidine Kinase, HK)蛋白和反应调节蛋白(Response Regulator, RR)组成,HK含有2个功能域,即HATPase_c和HisKA功能域。当外界信号作用于组氨酸激酶蛋白的膜外配体结合区时,激活激酶的ATP结合部位(HATPase_c domain), HATPase_c功能域可结合、水解ATP为ADP,并将ATP的磷酸基团转移到激酶HisKA功能域的组氨酸位点,使其发生自身磷酸化。随后,反应调节蛋白调控区域能与磷酸化的组氨酸蛋白激酶相互作用,将激酶上的磷酸基团转移到自身天冬氨酸位点上,发生自身磷酸化,并能激活效应区,使其构像改变,暴露不同DNA结合位点,结合不同DNA序列产生一系列调控反应。已有的研究发现表皮葡萄球菌的生物膜形成分为两个主要阶段：单个细菌初始黏附到材料表面和细菌间的互相黏附形成多细胞层的结构,并且已发现了参与这两个阶段的一些生物膜相关基因(如atlE、ica、aap等)。目前已知在金葡菌中SaeRS调节毒力相关因子,比如¨SPA, Clumping factor等,而在表葡中其生物学作用及相关机制未见详细报道。TCSs广泛存在于革兰阳性菌和革兰阴性菌中,其不仅参与细菌的基本生命活动,目前也发现它与很多病原菌的毒力和致病性密切相关。SaeRS在表皮葡萄球菌中的研究还知之甚少,故本论文在建立了表皮葡萄球菌双组分信号转导系统SaeRS删除株的基础上,对其生物学活性和介导自溶和生物膜形成相关机制进行了较全面的研究,并对胞外基质中Aap蛋白及PIA重要成分在表皮葡萄球菌生物膜形成过程中的作用及进行了较深入的研究。借助于基因芯片和双向电泳技术,寻找潜在的受SaeRS调节的基因和蛋白,并对其生物学特性进行了研究。第一章表皮葡萄球菌saeRS基因删除株的构建在金黄色葡萄球菌中研究发现SaeRS与细菌许多生物学功能有关,而其在表皮葡萄球菌中的生物学功能尚无报道。为了探讨表皮葡萄球菌SaeRS双组分信号转导系统的saeS基因和saeS基因删除对细菌生物学功能的影响,我们构建了含有壮观霉素抗性基因(spc)的saeRS删除质粒saeRS随后将电转入表皮葡萄球菌1457菌株的重组质粒在43℃条件下振摇培养,筛选saeRS缺失突变株,并对获得的删除突变株进行PCR、测序及生物化学反应试剂条鉴定,确证为表皮葡萄球菌1457 SaeRS缺失突变株(SE1457△saeRS)。不同的微生物宿主含有不同的复制起始子和抗性基因等,因此一种位点特异性的基因重组删除基因的方法不可能适用于所有的细菌种类。在富含AT碱基的革兰染色阳性的表皮葡萄球菌1457中利用质粒pMAD定向删除基因。pMAD为穿梭质粒,可在革兰阴性的大肠埃希杆菌和革兰阳性的葡萄球菌中扩增。因为自大肠埃希菌中抽提质粒方法简便,实验流程往往是在大肠埃希菌中扩增pMAD重组质粒后,再导入葡萄球菌。然而表皮葡萄球菌细胞不接受直接来自革兰阴性杆菌的质粒,而金黄色葡萄球菌RN4220是一种缺陷型革兰阳性菌,可以接受来自革兰阴性菌的质粒。重组质粒在金黄色葡萄球菌RN4220中经过宿主菌的修饰后即可被表皮葡萄球菌细胞接受。本研究以双组分信号转导系统为目的基因,采用载体pMAD构建重组质粒,电转表皮葡萄球菌1457,筛选突变株。pMAD筛选方法简便高效,只需一步筛选过程就可得到突变株,但pMAD质粒较大(9.66 kb),含多克隆位点较少,重组质粒的构建和转化比较困难。第二章表皮葡萄球菌saeRS基因删除株生物学表型的研究为观察saeRS删除对细菌生物膜形成的影响,我们采用细菌生物膜微量板半定量方法检测saeRS删除突变对细菌生物被膜形成的影响,结果表明SE1457△AsaeRS株形成生物被膜的能力明显高于野生株。细菌初始黏附实验检测野生株和SE1457△AsaeRS株黏附到多聚物材料表面的能力,结果表明野生株和SE1457△AsaeRS株黏附到多聚物表面的能力没有差异。通过检测OD570值观察其生长情况,结果显示SE1457△AsaeRS株与野生株的生长曲线相似,saeRS基因删除对细菌增殖无明显影响。然而在细菌振荡培养24h后检测到SE1457△AsaeRS的CFU计数明显低于野生株(大约降低logl CFU/ml)。进而采用0.25% Triton X-100诱导细菌自溶的方法检测SE1457AsaeRS株和野生株自溶的差异,结果显示SE1457△AsaeRS株的裂解率比野生株高达50%。为更好的观察表皮葡萄球菌形成生物膜的内部结构形态、成分分布及细菌状态等,我们建立了激光共聚焦显微镜及扫描电镜和透射电镜观察表皮葡萄球菌生物膜的体外培养系统。利用这些体外培养系统可以观察表皮葡萄球菌生物膜中的微克隆,经各种不同荧光染料的染色后可以在激光共聚焦显微镜下清晰的观察到生物膜的形态结构及内部细菌的生理状态。表皮葡萄球菌生物膜的形成及其调控是非常复杂的过程。表皮葡萄球菌生物膜的形成主要分为两个阶段：单个细菌初始黏附到材料表面；细菌之间互相黏附,形成多细胞层的结构。目前已发现了参与这两个阶段的一些功能基因(如atlE, icaADBC、aap、bap等),其中icaADBC编码细胞间多糖黏附素(Polysaccharide Intercellular Adhesion, PIA),而PIA是表皮葡萄球菌生物膜的主要成分之一,PIA在生物膜形成能力增强的SE1457△AsaeRS中产量也有明显增加。通过SE1457AsaeRS全蛋白的双向电泳分析,我们得知Aap蛋白受SaeRS调节,提示Aap可能在SE1457AsaeRS的生物膜形成中发挥了重要作用。通过基因芯片以等方法,发现参与生物膜形成第二阶段的一些基因在突变株中的转录水平明显降低,如phoR转录水平降低2.05倍。但凝胶迁移阻滞实验(EMSA)未能证明SaeR可以与phoPR的启动子区特异性结合。第三章表皮葡萄球菌双组分系统SaeRS删除株表达谱和蛋白谱的比较分析基因芯片技术的基本原理是将大量寡核苷酸分子固定于支持物上,然后与标记的样品进行杂交,通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。目前尚无商品化的表皮葡萄球菌基因芯片,本实验室与Genomic Research Laboratory (Geneva, Switzerland)及上海基因芯片公司合作,以经过测序并注释的表皮葡萄球菌ATCC12228和ATCC35984为基础,设计引物通过PCR扩增出两千三百多个ORF的DNA片段,并制作了cDNA芯片；对于不能扩增出DNA片段的约二百多个ORF,则合成寡核苷酸制作oligo芯片。本研究使用基因芯片对表皮葡萄球菌SE1457中的SaeRS双组分信号转导系统缺失后的基因表达谱的变化进行了分析。我们获得了一些感兴趣的已知与自溶能力有关的基因,如glpQ, arlR, lytS, lrgA等。经实时定量RT-PCR验证,上述基因的表达变化水平与芯片结果很接近。使用蛋白组学技术对表皮葡萄球菌SE1457中的SaeRS双组分信号转导系统缺失后的蛋白表达谱的变化进行了分析,我们发现与生物膜形成有关的Aap蛋白(SE1457△saeRS突变株中表达上调10倍)。本论文通过构建表皮葡萄球菌SaeRS删除株,研究SaeRS在表皮葡萄球菌中调控自溶以及生物膜形成中的作用,并通过基因芯片和蛋白组学方法研究受SaeRS调节的基因及蛋白,更为明确了表皮葡萄球菌双组分信号转导系统SaeRS的调节网络,为研究抗表皮葡萄球菌药物也奠定了一定的基础。