草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国重要养殖鱼类之一,其产量居于我国乃至世界淡水养殖产量首位。利用草鱼高密度遗传连锁图谱进行数量性状座位(quantitative trait locus,QTL)定位是一种快速、有效地开发经济性状相关标记的方法。草鱼首张遗传连锁图谱已于2010年发表,但关于草鱼经济性状QTL精准定位的工作尚未开展。本研究利用高通量测序数据,构建了草鱼首张高密度遗传连锁图谱,并对部分生长性状和肌肉营养成分进行QTL定位;利用极端体质量个体进行混池转录组测序,对体质量性状进行初步定位。本研究旨在筛选出草鱼生长性状和肌肉营养成分相关标记和基因,以期为草鱼分子标记辅助选择(marker assisted selection,MAS)育种提供参考,主要研究内容如下:1.草鱼高密度遗传连锁图谱构建对草鱼F1作图家系进行简化基因组GBS(genotyping by sequencing)测序,构建一张草鱼高密度遗传连锁图谱,以期为后续草鱼幼鱼经济性状QTL精准定位提供参考。利用自主研发的12个微卫星标记对草鱼子代家系信息进行鉴定,选取家系2(2个亲本,185个子代)为作图群体。GBS测序共获得2,608,276,786 clean reads(过滤后数据平均clean reads为13,948,004,平均Q30和GC含量分别为95.68%和46.51%)。参考草鱼雌性基因组,使用Samtools和GATK对测序质控结果进行SNP分型,取两者交集共21,733个多态性SNPs,经后续严格过滤,最终用3,979个SNPs标记构建了草鱼高密度遗传连锁图谱。该高密度图谱共24个连锁群(linkage,LG),总长度为1,752.74 cM,标记间平均距离为0.440 cM;各连锁群上标记数介于46-232(LG2最多,LG9最少,平均165.79);各连锁群总长度介于46.773-127.050 cM(LG2最长,LG18最短,平均73.031 cM);各连锁群中标记平均间隔为0.263-2.106 cM(LG9最大,LG24最小,平均0.44 cM);各连锁群中最大间隔介于2.161-35.133 cM(LG2最大,LG23最小,平均7.867 cM);各连锁群上标记间隔小于5 cM的比例介于93.48-100%,平均99.27%。2.10月龄草鱼生长性状QTL定位利用构建的高密度遗传连锁图谱对10月龄草鱼的5个生长性状进行QTL定位,共检测出5个生长性状显著相关的35个QTLs。13个QTLs与10月龄草鱼体质量性状显著相关,LG7、LG11、LG20和LG23中各有1个可分别解释13.6%、9.7-12.8%、30.8%和17.1%表型变异的QTL,LG19中有9个QTLs可解释8.3-20.5%的体质量变异;其中,qBWE19-3和qBWE20-12可分别解释20.5%和30.8%的体质量变异。8个QTLs与体长性状显著相关,其中6个(qBL11-1、qBL19-4、qBL19-5、qBL19-6、qBL19-7和qBL23-8)与体质量显著相关的QTLs重叠,其余2个QTLs分别位于LG11和LG13、解释14.3%和9.1%表型变异。与体高显著相关的10个QTLs中,除了qBH19-7以外,其余9个均与体质量相关QTLs重叠(其中4个同时与体长相关QTLs重叠);此外,qBH20-10可解释32.8%体高变异。与体宽显著相关的qBWI7-1与qBWE7-1重叠,另一个QTL位于LG16(可解释10.1%表型变异)。与肥满度性状显著相关的2个QTLs不与其他重叠,分别位于LG18的12.413 cM和13.601 cM处,可分别解释13.1%和11.1%的表型变异。3.10月龄草鱼肌肉营养成分QTL定位利用高密度图谱对10月龄草鱼的13种肌肉营养成分进行QTL定位,6种肌肉营养成分(羟脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸含量)未检测到显著相关QTLs,其他7种肌肉营养成分共检测到47个显著相关QTLs、包含71个SNPs。草鱼肌肉营养成分显著相关的47个QTLs中,与粗脂肪、粗蛋白、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸和缬氨酸含量相关的QTL分别为14、7、15、2、3、2和4个。14个粗脂肪相关的QTLs分别定位于LG4(1个)、LG7(2个)、LG14(6个)、LG16(2个)和LG21(3个)中,可解释8.3-21.5%的表型变异,其中qCF4-1和qCF14-5可分别解释21.5%和21.1%表型变异。粗蛋白相关的1个QTLs位于LG5,可解释9.7%的表型变异;其余6个QTLs位于LG22,可解释8.8-21.8%的表型变异;其中,qCP22-3可解释14.9-21.8%表型变异。精氨酸相关15个QTLs分别位于LG1(1个)、LG4(2个)、LG12(11个)和LG13(1个),可解释8.6-45.9%的表型变异,其中qArg4-3和qArg13-15可分别解释45.2-45.9%和24.0%的表型变异。2个组氨酸相关QTLs分别位于LG8和LG11,分别解释30.0%(qHis8-1)和11.1-11.3%的表型变异。赖氨酸相关的2个QTLs位于LG12,可解释9.9-12.4%表型变异;位于LG13的QTL(qLys13-3)可解释28.7%的表型变异。2个脯氨酸相关QTLs分别位于LG13和LG19,分别解释15.9%和9.1%表型变异。4个缬氨酸相关QTLs分别位于LG4、LG12、LG14和LG24,可解释8.5-19.3%的表型变异。4.10月龄草鱼生长相关插入/缺失位点筛选及图谱定位本课题组前期在利用SSR标记对草鱼生长性状进行QTL分析时,在第1代遗传连锁图LG15中定位到1个与体质量相关的QTL,而该QTL跨越草鱼全基因组3个scaffolds(拼接序列)。本研究基于以上相关序列,通过短片段重复序列(short tandem repeat,STR)分型技术对插入/缺失型变异位点进行筛选,进而对高密度图谱进行位点补充和加密。结果发现:(1)草鱼3个scaffolds中85个插入/缺失型突变位点中有41个为SSRs,8个位点设计引物不成功,设计的36对引物均能扩增和分型成功;(2)直接测序结果表明STR分型技术不仅可准确对插入/缺失型突变位点进行分型,同时可降低分型成本;(3)这36个位点在野生群体中的平均Ne、Ho、He和PIC分别为1.4976、0.3190、0.2970和0.2349;(4)仅有7个位点在选育群体中具有多态性,将7个多态性位点与323尾10月龄草鱼生长性状进行关联分析,发现除位点ID-10H和ID-41F以外,其余5个位点都与10月龄草鱼的一个或多个生长性状显著相关(P<0.05),其中ID-6H与肥满度性状显著相关(P<0.05)、位点ID-11F、ID-15F、ID-32F和ID-39F与草鱼幼鱼体质量、体长、体宽或体高性状显著相关(P<0.05);(5)对7个多态性位点进行图谱定位,最终将其定位于草鱼高密度图谱的LG15中。综上,利用STR分型技术可降低草鱼插入/缺失型位点验证,以上生长相关位点可为草鱼MAS育种提供参考。5.利用混池转录组测序技术挖掘10月龄草鱼体质量性状相关标记和基因选取10月龄草鱼家系中体质量极端个体,利用混池转录组测序分析(bulked segregant analysis by RNA-seq,BSR-seq)对体质量性状进行初步定位,挖掘10月龄草鱼体质量相关的分子标记和基因。对6个混池组(极大、极小各3组)总RNA进行检测,发现各组总RNA的OD280/260、RIN值、28S:18S和总量分别介于1.85-1.94、6.8-7.4(>6.5)、1.1-1.9(>1)和5.24-7.75 ng(>2 ng),满足建库要求。混池转录组测序得到各组的原始数据量、GC含量和Q30比例分别介于6.9560-8.0913G、47.02-48.73%和90.30-91.34%,各组有效数据的86.60-89.23%能比对到雌性草鱼基因组上;对体质量大、小组间的525个差异基因进行GO和KEGG富集分析,GO富集筛选出骨骼肌组织发育、骨骼肌器官发育、横纹肌组织发育、肌肉组织发育、肌肉器官发育、肌肉结构发育等31个显著富集(p-classicFisher<0.05)的GO条目,KEGG富集显示这些差异基因显著富集(qvalue<0.05)于肌动蛋白细胞骨架调节、mTOR信号通路等12个KEGG代谢通路。此外,利用欧式距离算法对体质量差异组合进行初步定位,共得到171个候选区间,对区间进行注释,得到164个候选基因;结合上文差异基因分析,共筛选出8个体质量相关的候选差异基因,其中6个有对应基因注释(AKT1S1、SVIL、CMYA5、EIF4G1、Pdlim5和Myosin heavy chain)。本研究利用混池转录组测序技术挖掘出一批与草鱼体质量相关的候选标记和基因,可为草鱼进一步图谱加密和验证提供参考。