鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我国常见的恶性肿瘤,好发于南方地区,其发病有明显的种族地区和家族地区聚集现象。据估计,世界上80%的鼻咽癌发生于我国。鼻咽癌发病率占头颈部肿瘤的首位,发病年龄在3-84岁之间,以30-50岁多见,男性发病为女性的2-3倍。鼻咽癌已经成为严重威胁我国人民生命和健康的十大恶性肿瘤之一。鼻咽癌多属低分化鳞状细胞癌,大多数对放射治疗有中度敏感性,其邻近结构对放射线亦有较高的耐受性,因此,目前治疗鼻咽癌的主要手段是放射治疗结合全身化疗。但临床发现患者的放射敏感性存在个体差异,导致治疗效果亦出现很大的不同。为此,增加鼻咽癌患者的放射敏感性已成为鼻咽癌临床治疗的迫切需求。影响肿瘤细胞放射敏感性的因素很多,细胞凋亡是重要因素之一。自1972年Kerr发现自然界存在细胞凋亡现象以来,人们对凋亡的认识不断加深,并陆续发现了如NF-κB、mTOR等一系列信号转导通路在调控肿瘤细胞的凋亡发挥重要作用,同时也促进了鼻咽癌细胞凋亡机制的研究。许多研究表明,如果控制细胞增殖、分化的信息传递通路中某一环节异常,就会引起细胞生长失控,可以导致肿瘤形成或者肿瘤凋亡。在介导肿瘤细胞凋亡的众多信号转导途径中,以NF-κB、mTOR信号转导途径对凋亡的调节作用较为重要。NF-κB、mTOR信号传导通路活化可以抑制多种刺激诱发的细胞凋亡,促进细胞周期进展,从而促进细胞的生存和增殖,同时参与血管形成,在肿瘤的形成中扮演重要角色,并参与肿瘤的侵袭和转移。而且该信号传导通路还通过诱导肿瘤细胞生存、分化和血管形成,在恶性肿瘤的发生发展、耐药及放射抵抗方面发挥重要作用,也因此成为肿瘤干预治疗的新靶点。已有研究发现阿司匹林是核转录因子NF-κB重要的抑制剂,而雷帕霉素又是mTOR特异性抑制剂,因此我们可以用雷帕霉素抑制mTOR及用阿司匹林调控NF-κB的活性,干预鼻咽癌细胞信号通路的传导,从而诱导鼻咽癌细胞凋亡,抑制由mTOR、NF-κB通路介导的鼻咽癌细胞对放疗的抵抗性,进而增加临床肿瘤治疗的疗效,可为解决鼻咽癌放射抵抗提供理论基础及实验依据。第一部分:阿司匹林对鼻咽癌细胞株SUNE放射后凋亡促进作用及放射增敏作用的研究一、目的观察阿司匹林(Aspirin,ASA)对鼻咽癌SUNE细胞系放射后凋亡促进作用及放射增敏作用,并探讨其可能机制。二、方法1、MTT法检测不同浓度的阿司匹林的SUNE细胞增殖抑制情况,并选出对SUNE细胞增殖无影响的浓度。2、在对SUNE细胞增殖无影响的阿司匹林浓度作用下,检测不同放射剂量(2Gy、4Gy、8Gy)对SUNE细胞生长抑制的情况。3、流式细胞仪法检测、比较各组的细胞凋亡率变化。4、免疫荧光技术及流式细胞仪检测各组在阿司匹林处理后及放射前后SUNE细胞NF-κB的表达情况。三、结果1、不同浓度梯度的阿司匹林作用24h后,SUNE细胞增殖抑制率随药物的浓度的增加而增加并存在量效关系;当阿司匹林浓度ASA≤2 mmol/L对细胞的抑制率与对照组无显著统计学差异(P＞0.05)。2、依据析因设计方差分析,不同放射剂量间细胞生长抑制率有显著差异(P=0.000),且随放射剂量的增加而增加;加阿司匹林和不加阿司匹林两组细胞间生长抑制率有显著性差异(P=0.000),加阿司匹林组明显高于不加阿司匹林组;阿司匹林与放射剂量的交互效应显著(P=0.000),加阿司匹林后再照射8Gy对细胞的增殖抑制最明显。而独立样本t检验显示,在2、4、8 Gy每种相同的放射剂量下,阿司匹林+照射组的生长抑制率显著高于单纯照射组,两者统计学差异均具有显著性(P=0.000)。one-way ANOVA统计分析,在加阿司匹林组和不加阿司匹林组三个照射剂量之间均存在显著的统计学差异(P=0.000),进一步采用LSD法两两比较每组2、4、8 Gy三种照射剂量间的差异,均显示有显著的统计学差异(P=0.000)。3、免疫荧光技术显示,照射前SUNE细胞中NF-κB的表达信号弱,阳性信号(绿色)主要分布于胞质中,少见胞核表达,而在放射线照射(8Gy)后,细胞核中阳性信号明显增强;阿司匹林(2mmol/L)处理细胞后,再行照射8Gy,细胞核中的阳性信号与单纯照射组相比明显变弱。利用流式细胞仪分析细胞质中NF-κB的阳性细胞数,单纯照射组较对照组及单纯阿司匹林处理组NF-κB的表达显著降低,而照射+阿司匹林组细胞质内NF-κB表达则较单纯照射组显著升高。4、流式细胞仪显示,阿司匹林(2mmol/L)抑制NF-κB的表达后再照射(8Gy)能使射线诱导的细胞凋亡增加。经One-Way ANOVA分析发现,对照组、单纯阿司匹林组、单纯照射组、照射+阿司匹林组四组之间的表达有显著性差异(P=0.000),进一步采用LSD法比较,对照组与单纯阿司匹林组细胞凋亡率无显著差异(P=0.571),单纯照射组、照射+阿司匹林组分别与对照组及单纯阿司匹林组均有显著性差异(P=0.000),而照射+阿司匹林组较单纯照射组凋亡率显著增加且具有统计学意义(P=0.000)。四、结论1、阿司匹林在体外能抑制鼻咽癌细胞SUNE的增殖,并存在量效关系。当阿司匹林的浓度≤2 mmol/L时,对鼻咽癌细胞SUNE生长无抑制作用。2、阿司匹林明显增加了放射线诱导的鼻咽癌细胞SUNE凋亡。表明阿司匹林有增加鼻咽癌细胞SUNE放射敏感性的作用。3、鼻咽癌细胞SUNE中NF-κB-p65蛋白主要分布于细胞质内,以失活状态为主,射线照射引起大部分细胞凋亡,但存活细胞中NF-κB-p65蛋白由细胞质移位至细胞核中,NF-κB呈活化状态。4、射线能激活鼻咽癌细胞的NF-κB,激活后的NF-κB由胞质向胞核转移,而这种转移可以被阿司匹林抑制。5、表现活化状态NF-κB的细胞可能对放射线不敏感,而在阿司匹林抑制NF-κB活化后,细胞的凋亡率明显增加,表明阿司匹林增加鼻咽癌细胞SUNE的放射敏感性可能与抑制NF-κB的激活有关。第二部分:雷帕霉素对鼻咽癌细胞株SUNE放射后凋亡促进作用及放射增敏作用的研究一、目的观察雷帕霉素(Rapamycin,RPM)对鼻咽癌SUNE细胞系放射后凋亡促进作用及放射增敏作用,并探讨其可能机制。二、方法1、免疫组织化学检测鼻咽癌组织中Akt和mTOR的表达情况。2、MTT法检测不同浓度的雷帕霉素对SUNE细胞株的增殖抑制情况,并选出对SUNE细胞株增殖无影响的雷帕霉素浓度。3、在对SUNE细胞增殖无影响的雷帕霉素浓度作用下,检测不同放射剂量(2Gy、4Gy、8Gy)对SUNE细胞生长抑制的情况。4、流式细胞仪法检测、比较各组的细胞凋亡率变化。5、免疫荧光技术检测各组mTOR的表达情况。6、Westblotting技术检测Akt、p-Akt蛋白。三、结果1、在60例鼻咽癌组织中,Akt表达阳性的有49例,阳性率是81.7%,阳性信号主要位于鼻咽癌细胞浆内,mTOR表达阳性的有45例,阳性表达率是75%,阳性信号主要也位于鼻咽癌细胞浆内,其中两者均阳性的有40例。经χ~2检验统计分析,Akt、mTOR两者的阳性表达强度显著正相关(P=0.034)。2、不同浓度梯度的雷帕霉素作用24h后,细胞增殖抑制率随药物的浓度的增加而增加并存在量效关系;浓度雷帕霉素≤1nmol/L对细胞的抑制率与对照组无显著统计学差异(P＞0.05)。3、随放射剂量的增加,SUNE细胞生长抑制率在雷帕霉素+照射组及单纯照射组均逐渐增高,但雷帕霉素+照射组抑制率明显高于单纯照射组。依据析因设计方差分析,不同放射剂量问细胞生长抑制率有显著差异(P=0.000),且随放射剂量的增加而增加;加雷帕霉素和不加雷帕霉素两组细胞问生长抑制率有显著性差异(P=0.000),加雷帕霉素组明显高于不加雷帕霉素组;雷帕霉素与放射剂量的交互效应显著(P=0.000),加雷帕霉素后再照射8Gy对细胞的增殖抑制最明显。而独立样本t检验显示,在2、4、8 Gy每种相同的放射剂量下,雷帕霉素+照射组的生长抑制率显著高于单纯照射组,两者统计学差异具有显著性(P=0.000)。one-way ANOVA统计分析,在加雷帕霉素组和不加雷帕霉素组三个照射剂量之间均存在显著的统计学差异(P=0.000),进一步采用LSD法两两比较每组2、4、8 Gy三种照射剂量间的差异,均显示有显著的统计学差异(P=0.000)。4、流式细胞仪显示,雷帕霉素(1nmol/L)处理SUNE细胞后再照射(8Gy)明显能增加射线诱导的细胞的凋亡。经One-Way ANOVA分析发现,对照组、单纯雷帕霉素、单纯照射组、照射+雷帕霉素组四组之间的凋亡率有显著性差异(P=0.000),进一步采用LSD法比较,对照组与单纯雷帕霉素组细胞凋亡率无显著差异(P=0.843),单纯照射组、照射+雷帕霉素组分别与对照组及单纯雷帕霉素组均有显著性差异(P=0.000),而照射+雷帕霉素组较单纯照射组凋亡率显著增加且具有统计学意义(P=0.000)。5、荧光显微镜下显示,SUNE细胞中mTOR阳性表达信号(绿色)主要分布于细胞浆中,少见胞核表达,在放射线照射(8Gy)及加用雷帕霉素(1nmol/L)后,虽然细胞大部分细胞死亡,但未死亡的细胞的胞浆中阳性信号没有明显变化;蛋白免疫印迹技术检测到Akt量在放射线照射(8Gy)前后及应用雷帕霉素(1nmol/L)处理细胞前后均不变,而磷酸化Akt在雷帕霉素处理后明显下降,表明射线对Akt、mTOR的表达无影响,雷帕霉素促进鼻咽癌细胞凋亡主要是通过抑制Akt的磷酸化而实现的。四、结论1、mTOR、Akt在鼻咽癌组织中均有较高的表达,且二者有显著的正相关。2、雷帕霉素在体外能抑制鼻咽癌细胞SUNE的增殖,并存在量效关系,当其浓度≤1nmol/L时,对鼻咽癌细胞生长无抑制作用。3、雷帕霉素明显增加了放射线诱导的鼻咽癌细胞SUNE凋亡。表明雷帕霉素有增加鼻咽癌细胞SUNE放射敏感性的作用。4、鼻咽癌细胞SUNE中mTOR蛋白主要分布于细胞质内,雷帕霉素、射线照射处理后虽可引起大部分细胞凋亡,但存活细胞胞浆中mTOR蛋白表达无明显变化。5、放射线、雷帕霉素不能使鼻咽癌细胞SUNE的Akt的总量改变,但雷帕霉素可抑制Akt的磷酸化,表明雷帕霉素增加射线诱导鼻咽癌细胞的凋亡和增强其放射敏感性可能与抑制Akt的磷酸化有关。6、Akt的过度磷酸化可能是导致鼻咽癌放射抵抗的原因之一。