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背景:应激是生命特征之一,氧化应激是生物主要应激方式。细胞氧化应激可产生大量活性氧（ROS）,引起蛋白氧化变性、DNA和脂类氧化损伤。感染是病原微生物和宿主相互作用的过程。近年文献报道,细菌感染宿主细胞过程中也可引起细胞氧化应激反应产生大量ROS。我们实验室已报道,致病性问号钩端螺旋体感染多种宿主细胞时均导致细胞产生大量ROS,引起DNA和线粒体膜损伤以及细胞凋亡。然而,感染过程中问号钩端螺旋体等原核细胞型微生物是否也产生基于ROS的氧化应激反应、主要ROS类型、ROS诱导的蛋白氧化变性和DNA氧化损伤或死亡以及过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和细胞色素C过氧化物酶抗氧化应激保护作用,迄今未见研究报道。方法:采用生物信息学软件分析我国优势致病性问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株产物注释为KatE过氧化氢酶（编号LA1859）、BtuE谷胱甘肽过氧化物酶（编号LA1007和LA4299）和MauG细胞色素C过氧化物酶（编号LA0666、LA2974和LA3139）基因结构和定位及其功能结构域。采用常规基因工程技术构建上述基因原核表达系统,Ni-NTA亲和层析法提取表达的目的重组蛋白rLepKatE、rLepBtuE1/2、rLepMauG1/2/3。采用分光光度法检测上述目的重组蛋白催化底物酶活性及其Km和Kcat值。采用激光共聚焦显微镜法检测问号钩端螺旋体赖株感染人单核细胞（THP-1）和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）过程中ROS水平变化,采用电子顺磁共振波谱法（EPR）检测其主要ROS类型。采用激光共聚焦显微镜、荧光分光光度法和ELISA分别检测ROS对问号钩端螺旋体活性、蛋白变性和DNA损伤作用。采用激光共聚焦显微镜法检测上述基因产物过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和细胞色素C过氧化物酶抑制前后问号钩端螺旋体赖株感染细胞过程中ROS水平变化。采用实时荧光定量RT-PCR检测感染细胞过程中上述问号钩端螺旋体赖株抗氧化酶基因表达水平变化。结果:LA1859基因含亚铁血红素结合Clade-3型过氧化氢酶结构域,LA1007和LA4299基因含谷胱甘肽过氧化物酶结构域,LA0666基因含双血红素细胞色素C过氧化物酶结构域但LA2974和LA3139基因则否。构建的原核表达系统能表达目的重组蛋白,提纯的目的重组蛋白SDS-PAGE后显示为单一蛋白条带。rLepKatE、rLepBtuE1/2 和 rLepMauG1 分别具有催化 H2O2、t-Bu-OOH 和cumene hydroperoxide 底物的酶活性,Km 和 Kcat 值分别为 21.137-92.190 μmol·L-1和 37.620-850.602 s-1,但 rLepMauG2/3 则否。感染人 THP-1 单核细胞和 HUVEC时问号钩端螺旋体赖株ROS水平显著升高（p<0.05）,感染8 h时ROS水平达到峰值,主要ROS类型为·OH（p<0.05）,但感染过程中问号钩端螺旋体赖株不产生NO。感染人THP-1单核细胞和HUVEC时分别有27.6%和7.5%胞外问号钩端螺旋体赖株死亡,37.8%和11.3%蛋白变性,产生18.61 ng/mL和5.56 ng/mL DNA氧化损伤标记物8-OHdG。采用感染细胞时问号钩端螺旋体赖株最高水平ROS相应H2O2作用后,其生长繁殖能力显著下降（p<0.05）。问号钩端螺旋体赖株过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和细胞色素C过氧化物酶被抑制剂抑制后,感染人THP-1单核细胞和HUVEC后ROS水平迅速升高（p<0.05）。感染细胞时上述问号钩端螺旋体赖株LepKatE-、LepBtuE1/2-和LepMauG1-mRNA水平显著升高（p<0.05）。结论:问号钩端螺旋体感染细胞时可产生氧化应激反应产生大量·OH为主的ROS,但不产生NO,高水平ROS可引起问号钩端螺旋体蛋白氧化变性、DNA氧化损伤并导致其死亡,问号钩端螺旋体过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和细胞色素C过氧化物酶可清除感染性ROS而有利于存活和生长繁殖,因而上述抗氧化酶是问号钩端螺旋体毒力因子。诱导问号钩端螺旋体自身感染性ROS和致死性氧化损伤可能是宿主抗菌新机制。