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近年来,病毒性偷死病（Viral covert mortality disease,VCMD）给我国对虾养殖产业造成了严重的损失,其病原为偷死野田村病毒（Covert mortality nodavirus,CMNV）。20132015年针对VCMD的分子流行病学调查结果显示,CMNV的流行率高、宿主种类多、流行范围广。对虾缺乏特异性免疫系统,无法采用研发和应用疫苗的防治策略来应对病毒性疫病的威胁,因此建立特异性强、灵敏度高的分子生物学检测方法,在养殖实践中尽早、准确和特异性筛查CMNV,切断病毒传播途径,杜绝CMNV进入养殖系统,是目前有效防控VCMD的主要技术方案。首先,本研究开发了一种基于TaqMan的CMNV一步法实时荧光定量RT-PCR（TaqMan RT-qPCR）检测方法,对检测体系中关键试剂的用量进行了优化,评估了此方法的灵敏度、特异性、重复性以及在实际样品检测中的应用效果。优化后的反应组份和程序如下:TaqMan RT-qPCR中25μL反应液包含2×One Step RT-PCR Buffer III 12.5μL,TaKaRa Ex Taq HS 0.4μL,Prime Script RT enzyme Mix II0.4μL,引物CMNV-TAQ-R1（10μM）0.5μL、CMNV-TAQ-F2（10μM）0.5μL,探针CMNV-TAQ-P1（10μM）0.5μL,CMNV阳性模板1μL,其余用RNase-free H2O补足;程序为:50.8℃15 min;94℃5 min;40个循环（94℃10 s,52.7℃30s）。该方法最低可检测到5.7×100拷贝的pMD20-CMNV标准质粒,24.1拷贝的CMNV RNA标准品,或者9.6 pg/μL感染CMNV的虾组织总RNA。该方法的诊断特异性（DSp）和诊断灵敏度（DSe）分别为96.2%和98.0%;分析还显示该方法能实现对CMNV的特异性检测,检测结果的批内及批间重复性好,能够在5.7×1005.7×108标准质粒浓度范围内实现对CMNV的准确定量检测。其次,本研究对本实验室前期研发的CMNV现场快速高灵敏检测试剂盒进行了性能参数的评估。结果显示,该CMNV检测试剂盒具有很高的特异性,与其它常见的对虾病原如黄头病毒（YHV）、白斑综合征病毒（WSSV）、肝胰腺细小病毒（HPV）、虾肝肠胞虫（EHP）、传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）和桃拉病毒（TSV）均无交叉反应。分析灵敏度测试结果显示该试剂盒可检测到82.4pg/μL感染CMNV的虾组织总RNA。通过对374份样品的检测,该方法与第二章建立的TaqMan RT-qPCR检测方法相比,DSp为95.3%,DSe为73.6%。此外,分析结果显示该试剂盒的检测重复性和稳定性较好。总体来说,本实验室研发的CMNV现场快速高灵敏度检测试剂盒,除去灵敏度略低于TaqMan RT-qPCR外,整体上能够满足在生产现场开展CMNV快速、特异和稳定检测的需求。再次,针对患病对虾中出现的野田村病毒变异株系——行动障碍野田村病毒（暂命名为Movement disorder nodavirus,MDNV）建立了RT-LAMP检测方法。前期在进行CMNV研究时发现,多批样品中病毒RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）基因序列存在较大程度的变异,其与CMNV的原始分离株RdRP基因片段的相似性仅为78%。患病对虾表现出沉底、游泳性能下降的特点。为了在检测中将其与CMNV原始株系区分开来,将其命名为MDNV。针对MDNV建立的RT-LAMP检测方法,其关键反应组份的优化用量如下:dNTPs浓度为1.2 mM、MgSO4浓度为4 mM,Bst 2.0 WarmStart?DNA Polymerase用量为0.8μL,Eva Green用量为0.8μL;最佳反应温度为65.8℃,反应时间为60 min。该方法特异性强,与其他常见的对虾病原如CMNV、EHP、IHHNV、WSSV、TSV和YHV等均无交叉反应。定量分析过程中,在2.07×1082.07×102标准质粒浓度范围内,起始模板浓度的log值与扩增循环数的相关性系数高（R2=0.981）。该方法为实现发病对虾样品中MDNV的检测提供了基础分析方法,并可以实现对MDNV的定量分析。最后,本研究采用RT-nPCR、RT-LAMP和TaqMan RT-qPCR三种方法对20162017年我国沿海省市养殖虾类中CMNV及MDNV的流行、分布和变异情况进行了分析。结果表明,养殖凡纳滨对虾、中国明对虾、日本囊对虾、斑节对虾和罗氏沼虾等种类中均可检测到CMNV阳性;在河北、山东、浙江、福建、广东和海南等省市采集的养殖对虾中均存在CMNV。基于RT-nPCR的检测结果显示,20162017年样品中CMNV的阳性检出率分别为11.8%（30/254）和7.8%（30/387）;基于RT-LAMP的分析结果显示,20162017年样品中CMNV的阳性检出率分别为6.7%（17/254）和3.9%（15/387）;基于TaqMan RT-qPCR的分析结果显示,20162017年样品中CMNV的阳性检出率分别为17.7%（45/254）和12.4%（48/387）;基于上述三种方法检测结果计算得出,20162017年样品中CMNV的阳性检出率分别为26.8%（68/254）和16.3%（63/387）;而基于RT-LAMP的分析结果显示,2016年样品中MDNV的阳性检出率为9.4%（24/254）。本研究表明,一方面我国多地养殖虾类中存在较高的CMNV阳性检出率,VCMD的流行和危害仍不容忽视;另一方面RdRp基因不断变异导致目前基于RdRp基因开发的CMNV分子生物学分析方法可靠性下降,假阴性检出风险升高;同时发病养殖对虾中出现了新的野田村病毒株系（MDNV）,且具有较高的流行率,其传播危害风险值得进一步探究和高度关注。