目的:肺癌是全球发病率最高,并且引起患者死亡最多的恶性肿瘤。虽然在过去的几十年,对肺癌的治疗已经取得了很大的进步,但是,由于各种基因背景下的复杂情况,患者长期生存率仍然不令人满意。因此,探索出发现新的癌基因/抑癌基因并阐释其发挥作用的分子机制是预防和治疗恶性肿瘤的重要课题。Hippo通路是近年来发现的一条调节细胞增殖和器官体积大小的信号传导通路,在胚胎发育和肿瘤形成过程中发挥着重要作用。有文献报道,在果蝇中,含有WW和C2结构域的蛋白家族(WWCs蛋白家族)可通过激活Hippo通路影响细胞增殖和器官发育,有报道指出在乳腺癌细胞中WWC1(KIBRA)不依赖于MST激酶引起LATS1磷酸化水平增加,激活Hippo通路,同时抑制乳腺癌细胞上皮间质转化,减弱癌细胞增殖能力,认为WWC1为抑癌因子。然而,日本学者Yohei Yoshihama等在胃癌的研究中却发现KIBRA/WWC1为高表达和aPKC的低表达,并与淋巴结转移和不良预后呈正相关。这些结果说明了WWCs蛋白家族在人类肿瘤中的作用是复杂的,许多深入的作用机制尚待被揭示。尽管有关WWCs在人类肿瘤中的作用研究较少,许多问题还没有搞清楚,但WWCs蛋白质结构中自身存在的WW结构域和C端ADDV结构域引起了我们极大的兴趣,我们猜测WW结构域和C端ADDV结构域可能会分别与Wnt通路中重要因子DVLs的PY基序和PDZ结构域存在结合的可能。我们知道Wnt通路中的重要分子DVLs正是通过PDZ结构域发挥其作用的。因此,我们推测:既然WWCs在Hippo通路中发挥作用,也就很有可能通过ADDV结构域与DVLs相互作用而对Wnt通路产生影响,从而在上游发挥调控Wnt与Hippo的交互作用。在本篇文章中,我们首先检测了WWC3在肺癌细胞系和肺癌切除标本中的表达水平,双向调控WWC3后对肺癌细胞的增殖和侵袭的影响,构建WWC3的突变体,检测WWC3是否能与DVLs相互作用以及这一作用是否影响WWC3与LATS1的相互作用,目的在于揭示WWC3引起Hippo通路与Wnt通路交互作用的分子机制。研究方法::我们收集了127例中国医科大学附属一院经手术治疗并包含完整随访资料的非小细胞肺癌患者的肿瘤组织及32例癌旁正常肺组织(距肿瘤区域5cm;石蜡包埋标本)。另外我们还收集了2016年手术切除的20例新鲜肺癌的组织标品。首先应用免疫组织化学染色的方法对WWC3在非小细胞肺癌的定位和表达情况进行检测,利用统计学分析(包括:卡方检验,Kaplan-Meier和Cox回归法)对WWC3与非小细胞肺癌的临床病理因素、患者的预后情况以及是否为肺癌患病的风险因素等进行分析。应用蛋白免疫印记法(Western blotting)对六种肺癌细胞系和一种永生化的人正常支气管上皮细胞系HBE中WWC3的表达情况进行检测;应用Western blotting和实时定量PCR技术(RT-qPCR)对20对肺癌组织和癌旁正常肺组织中WWC3的蛋白和mRNA水平进行检测;之后,在肺癌细胞系中双向调控WWC3的表达,利用集落形成实验、Transwell实验、MTT实验以及裸鼠皮下移植瘤和经尾静脉肿瘤转移实验检测WWC3在体内外对肺癌细胞增殖和侵袭转移能力的影响。通过荧光素酶报告基因、Western blotting,RT-qPCR和免疫荧光技术检测WWC3对Wnt/Hippo通路活性、两通路主要分子Dishevelled(DVLs)、Ste-20 family of protein kinase(MST1)、Large tumor supressor(LATS1)和Yes-associated protein(YAP)磷酸化水平,靶基因(c-myc,MMP7,cyclinD1,CTGF,cyclinE)蛋白和mRNA表达水平以及β-catenin/YAP入核水平的影响。利用免疫共沉淀、免疫荧光和GST-pulldown技术检测WWC3和Wnt通路中关键分子DVLs的结合情况以及二者结合所依赖的结构域。利用免疫共沉淀技术和Western blotting检测WWC3、DVL2和LATS1三者竞争性结合的关系以及三者交互作用引起的Hippo通路和Wnt通路活性的改变。采用SPSS22.0统计分析软件对实验数据进行分析,P<0.05说明结果具有统计学意义。结果:1.我们发现WWC3在肺癌细胞系(6/6)和56.7%(72/127)的肺癌病例标本中均表达减少,在22例新鲜的配对肺癌组织中WWC3 mRNA和蛋白表达水平明显低于其配对的癌旁正常组织。并且WWC3的低表达与非小细胞肺癌的低分化,高p-TNM分期,淋巴结转移密切相关。同时,Cox分析显示WWC3的低表达与高pTNM分期,淋巴结转移一起均为肺癌患病的风险因素。2.我们在WWC3低表达的肺癌细胞系H1299和LK2中转染WWC3质粒(经G418筛选),在WWC3相对高表达的A549和SPC细胞系敲除WWC3(经G418筛选),分别通过体外和体内实验(集落形成实验、Transwell实验、MTT实验和裸鼠皮下移植瘤形成实验及经鼠尾静脉远处转移实验)均证实转染WWC3通过抑制Wnt、上调Hippo通路活性发挥抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;敲除WWC3后结果相反。3.在其发挥作用的分子机制方面,我们发现WWC3可通过其自身的WW结构域和ADDV结构域(C端PDZ结合模体)与DVL2的PY基序和PDZ结构域直接结合,一方面,二者的结合阻碍了casein kinase 1ε(CK1ε)对DVL s的磷酸化,从而抑制了β-catenin的入核,发挥抑制Wnt通路活性的作用,而转染WWC3-△WW&ADDV则这一作用消失;另一方面,WWC3同样通过其自身的WW结构域与LATS1相互作用,使LATS1磷酸化水平上调,抑制YAP入核,上调Hippo通路活性,而转染WWC3-△WW则这一作用消失。此外,DVL2能够与LATS1竞争性结合WWC3,使LATS1的自体磷酸化水平减少,从而负性调控Hippo通路活性。结论:1.WWC3在非小细胞肺癌中低表达并与肺癌患者预后明显相关;2.体内外实验证明了过表达WWC3抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、侵袭和转移能力;3.WWC3通过激活Hippo抑制Wnt通路活性从而抑制非小细胞肺癌细胞增殖、侵袭和转移能力;WWC3的生物学功能依赖于其WW结构域和C端的PDZ结合模体的存在。4.WWC3通过其自身的WW结构域和PDZ结合模体(ADDV)与DVLs的PY基序和PDZ结构域直接结合。5.WWC3与DVLs结合阻碍了CK1ε对DVLs的磷酸化从而抑制Wnt通路;同时,二者结合又能减少LATS1的磷酸化水平进而负向调控Hippo通路。因此,WWC3是引起Wnt与Hippo两个通路交互作用的重要的上游分子。这些结果为非小肺癌细胞肺癌的早期诊断和基因治疗提供了实验和理论基础。