由于与宿主的健康及疾病密切相关,肠道菌群组成的分析已成为生命科学领域的重点研究目标。然而,粪便样品中细菌的高粘度及其与杂质固体等不均匀分布的干扰,以及DNA提取过程中亚优势种信息的丢失,严重影响了肠道菌群的分析结果。故本文从肠道微生物样品前处理手段出发,优化液相色谱技术样品处理条件,探讨该方法在提高肠道菌群分离、分析准确性和灵敏度的辅助效果。本文分为肠道菌群模式菌株和大鼠肠道菌群两部分实验,具体内容如下:1、肠道菌群模式菌株:采用高效液相色谱分别考察了肠道菌群模式菌株及各单菌的色谱行为,成功建立了HPLC分离、分析肠道菌群模式菌株的最佳洗脱条件,即0.10-0.70 mol/LNaCl,哌嗪-HCl缓冲液的阶梯式梯度洗脱。上样浓度为培养菌液(OD600=0.576)的5倍时,其最大上样量为500μL,该方法分辨率高,重现性好,结果稳定。通过高效液相色谱分离得到5个洗脱组分,结合多重PCR方法检测肠道菌群模式菌株的分离效果。结果显示:多重PCR检测方法能够快速、特异地检测5个洗脱组分中各自包含的细菌,扩增产物序列与Genbank数据库中相应参考序列的同源性均在98%以上;而对未处理样品的检测过程中则会出现假阳性、假阴性以及拖尾等错误条带。肠道菌群模式菌株高效液相色谱分离、分析方法的建立,为进一步研究真实粪便样本中肠道菌群组成及其多样性奠定基础。2、大鼠肠道菌群:以液相色谱技术作为粪便样品的前处理方法,进行了肠道菌群样品制备条件优化、液相色谱条件优化及其组分表征、菌体细胞回收及其DNA提取。高通量测序结果表明,混合式上样一步洗脱法(简称ML-OSE,即肠道菌群样品与色谱填料充分混合后,用含1.0 mol/LNaCl的哌嗪-HCl缓冲液直接洗脱)的处理组,其肠道微生物组成及其丰度明显高于未处理组,物种信息更为丰富而完整;并且ML-OSE组组内相似度高,结果稳定、重现性好。以样品中的总肠道菌、双歧杆菌属、青春双歧杆菌基因的绝对含量作为指标,采用荧光定量PCR检测的结果显示,相比于未处理组,ML-OSE组的总肠道菌、双歧杆菌属检测值分别提高了 1.17倍和1.16倍;ML-OSE组的青春双歧杆菌检出率可达81.02%-84.38%,未处理组仅为35.49%-44.91%。以上结果表明,液相色谱作为粪便样品前处理方法,不仅能大大提高微生物原始样品量、均匀度,提高样品基因组DNA的提取率,还实现了高质量的检测和测序分析,确保数据的科学可靠性。本方法具有室温下稳定操作、准确性高、灵敏度强、重现性好等优点,有助于现代分子生物学技术及高通量测序技术对真实、完整的肠道菌群的检测和分析。