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猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)是单链环状的DNA病毒，分为不致病性的猪圆环病毒Ⅰ型(PCV1)和致病性的猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)。近来，分子流行病学调查显示，当前PCV2的流行型正经历从PCV2a向PCV2b转变。而对于PCV的防治主要是注射相关的疫苗，Cap蛋白作为猪圆环病毒的特异性抗原蛋白，常用于开发亚单位疫苗。 本研究从浙江及周边地区的13个猪场的42份临床的病料中检测到13株PCV2的病毒株，利用邻接法分析其基因型归属结果显示:检测到的病毒株均属于PCV2b的不同的亚型，这也证实了之前报道过的PCV的流行趋势，逐渐从PCV2a型到PCV2b型的转变。 本研究以原核表达并纯化的PCV2 Cap蛋白为包被抗原，建立了双抗体夹心ELISA定量检测Cap蛋白的方法。经过优化反应体系得出最佳反应条件:包被液为pH8.5的Tris-HCl缓冲液、包被单抗5E11的浓度为2μg/ml、检测多抗浓度为0.5μg/ml、酶标二抗的稀释倍数为1∶4000、封闭液为含有5％脱脂奶的PBST、封闭时间为60分钟、稀释液为0.5％脱脂奶与5％蔗糖的PBST混合液、抗原与抗体的反应时间均为60分钟、底物反应时间为8-10分钟。通过用不同浓度Cap蛋白的OD值来建立标准曲线，从而检测待检样品中Cap蛋白的浓度。该方法具有高度特异性，与猪蓝耳病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪流感病毒(H3N2)、伪狂犬病毒(PRV)等均无交叉反应性。批内变异系数为1％-4％，批间变异系数为1％-9％，具有较好的可重复性。 我们实验室已经通过PCR扩增技术以PCV2-TZ0601(GenBank登记号EU257511.1)为模板来扩增PCV2的去核定位信号的ORF2基因，克隆到带有polyhedrin启动子和gp67强信号肽序列的杆状病毒转移载体pAcGP67A中，构建重组载体pAcGP67A-ORF2-ΔNLS，与致死缺失型苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒基因组共转染到昆虫Sf9细胞，构建重组杆状病毒rAc-dCap。将转染后的细胞用IFA检测，细胞培养上清和细胞裂解物用Western Blot分析。结果表明，细胞内表达产物和细胞上清均与PCV2 Cap单抗发生特异性反应，重组蛋白实现了分泌性表达。本研究进一步从感染时间和感染复数优化病毒扩增条件，并对Cap蛋白的表达条件进行优化。结果显示，当以MOI值为0.2接种Sf9细胞72小时，收获的重组杆状病毒滴度为1076TCID50/0.1 ml，相对于其他MOI接种病毒滴度最高;而当MOI值为5感染Sf9细胞72小时，收获的重组病毒蛋白表达量最高。经过双抗体夹心ELISA检测，分泌型表达载体表达Cap蛋白的浓度较低，为了获得高表达量的Cap蛋白，我们又选择了含有双启动子的表达载体pFastBac-Dual，分别以PCV2-TZ0601、PCV2-HZ0201(GenBank登记号AY188355.1)为模板来扩增PCV2的ORF2基因，将其分别克隆到转移载体pFastBac-Dual的两个多克隆位点区域，然后将构建的重组转移载体在Tn7转座子的作用下与E.coli DH10Bac感受态细胞中的杆状病毒基因组发生转座。通过抗性和蓝白斑筛选，获得重组穿梭载体Bacmid-2ORF2，转染Sf9细胞获得重组杆状病毒，用Western Blot以及IFA都能检测到Cap蛋白的表达。分泌型表达载体pAcGP67A以及pFastBac-Dual的表达载体均能够表达Cap蛋白，接下来我们将继续优化Cap蛋白的表达条件和蛋白的纯化，使之高效表达，Cap蛋白作为猪圆环病毒的特异性抗原蛋白，其高效表达为亚单位疫苗的研制提供了一个可行性的发展方向。