【摘 要】
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目的利用秀丽隐杆线虫建立重金属镉（Cadmium,Cd）暴露的慢性损伤模型,寻找线虫评价Cd暴露的敏感指标,探讨Cd对线虫卵子发生的影响,通过转录组测序和生物信息学分析筛选基因并探索验证Cd潜在的生殖毒性机制,为Cd暴露的精准防控和靶点治疗提供理论依据。方法首先观察Cd暴露对线虫寿命的影响;以体长和体宽、头部摆动频率和身体运动频率、后代数目、瞬时产卵率和宫内受精卵数目及状态为观察指标,检查Cd对线
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目的利用秀丽隐杆线虫建立重金属镉（Cadmium,Cd）暴露的慢性损伤模型,寻找线虫评价Cd暴露的敏感指标,探讨Cd对线虫卵子发生的影响,通过转录组测序和生物信息学分析筛选基因并探索验证Cd潜在的生殖毒性机制,为Cd暴露的精准防控和靶点治疗提供理论依据。方法首先观察Cd暴露对线虫寿命的影响;以体长和体宽、头部摆动频率和身体运动频率、后代数目、瞬时产卵率和宫内受精卵数目及状态为观察指标,检查Cd对线虫生长发育、神经系统和生殖能力的影响。随后探索Cd暴露对卵子发生具体过程的影响,以有丝分裂区细胞数目评价Cd暴露对有丝分裂区生殖细胞的影响;对减数分裂区,以过渡区细胞数目和核形态判断Cd是否影响细线期和偶线期;以粗线期细胞数目和凋亡水平评价Cd暴露对粗线期的影响;以终变期细胞数目和-2期细胞的横径评价Cd暴露对终变期的作用;子代雄虫率用于判断Cd暴露对减数分裂染色体分离的影响。对线虫进行转录组测序并利用差异基因富集分析和RT-q PCR得到可能与Cd致生殖损伤相关的目的基因,结合竞争性内源RNA理论（competing endogenous RNA,ce RNA）预测其潜在调控网络,并使用基因敲除突变株线虫验证目的基因是否参与调控了Cd致卵子发生损伤过程。使用SPSS 21.0软件进行统计学分析,检验水准为α=0.05。转录组测序的结果使用R 3.6.3软件分析。结果1.Cd对线虫的一般毒性:Cd（10、30和60μM）暴露后线虫寿命明显缩短。线虫的运动能力在长期暴露8d时才明显下降（P＜0.05）,提示线虫神经系统可能对Cd不敏感。Cd可明显影响线虫的生长发育,短期暴露2d可观察到线虫体型的明显差别（P＜0.05）;Cd暴露后线虫后代数目减少,生殖高峰和生殖周期延长,宫内受精卵数减少,且处于晚期的受精卵增多（P＜0.05）,表明Cd严重损害了线虫的生殖能力。2.Cd损伤线虫卵子发生过程:Cd可降低线虫总生殖细胞数目、有丝分裂区和减数分裂区生殖细胞数目（P＜0.05）,但并未改变细胞形态。Cd暴露后减数分裂细线期和偶线期细胞形态和数目的差异无统计学意义,提示Cd可能并未影响细线期和偶线期;粗线期细胞数目减少,凋亡细胞数目增多,终变期细胞数目以及-2期卵母细胞的横径也显著下降（P＜0.05）,说明Cd可能影响了线虫除细线期和偶线期外的卵子发生过程。3.转录组测序及功能富集分析获得生殖相关基因:对线虫进行转录组测序可发现线虫全转录组表达水平的变化,其中有1628个显著上调mRNA和1539个显著下调的m RNA（Fold Change＞1.5,P＜0.05）。对差异表达m RNA的富集分析发现下调m RNA富集的功能和通路多与卵子的发生发育有关。根据富集分析结果和wormbase数据库关于基因的描述,得到可能与Cd致生殖损伤相关的目的基因mom-2、dsh-2、vang-1和cul-6,RT-q PCR结果显示暴露后目的基因的表达趋势与测序结果基本一致。对目的基因进行ce RNA网络的构建,最终得到包含3个m RNA（无cul-6）,4个mi RNA（mi R-1824-5p,mi R-2221,mi R-238-5p和mi R-243-5p）,5个circ RNA及26个lnc RNA的ce RNA网络。4.与Cd致生殖损伤相关的信号网络研究:使用mom-2、dsh-2、vang-1和cul-6基因突变株线虫,观察Cd暴露后突变株有丝分裂,减数分裂粗线期和终变期的变化。暴露后mom-2、dsh-2、vang-1和cul-6突变株有丝分裂区细胞减少程度与对照组相比没有差异（P＞0.05）,说明他们可能均未参与调控Cd导致的有丝分裂区细胞增殖损伤,而Wnt通路相关基因mom-2、dsh-2和vang-1的突变株线虫Cd暴露后的凋亡水平较对照组显著高,终变期细胞数目显著降低（P＜0.05）。表明Cd可能通过影响Wnt通路的信号传导诱导生殖细胞凋亡,进而导致生殖毒性。结论1.线虫的发育和生殖相关指标是评价Cd毒性的敏感指标。2.Cd暴露会影响除减数分裂细线期和偶线期外的卵子发生过程。3.通过转录组测序和RT-qPCR得到的差异表达的Wnt通路关键因子mom-2,dsh-2和vang-1可能参与负向调控Cd诱导的生殖细胞凋亡,并初步构建了ceRNA调控网络。
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