上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer,EOC)是女性最常见的生殖系统恶性肿瘤之一。目前,EOC在发达国家的病死率已居妇科肿瘤之首。对恶性肿瘤而言,肿瘤细胞除了呈现活跃的增殖状态外,受到威胁最严重的是肿瘤细胞所表现出来的侵袭迁移特性。目前,国内外对影响肿瘤细胞的生物学功能的部分基因已进行了相关靶点实验及探索,对其靶点进行干预的同时也促进了肿瘤治疗的发展,为靶向治疗提供了更多的参考。对于EOC而言,通过明确某些基因的异常表达是否能够引起上皮性卵巢癌细胞生物学行为的改变,进而探讨其调控机制,对EOC病因机制的深入研究及长远靶向治疗具有重要意义。转录因子FOXC1(forkhead box C1)是叉头框转录因子基因家族(FOX家族)的一员,是通过自身的叉头区DNA结合域结合目的基因片段从而启动相关基因转录。FOXC1除了参与细胞或器官分化及代谢等生物学过程外,目前证实FOXC1还可以调控多种肿瘤细胞信号传导途径,如NF-κB、Wnt/β-Catenin等。这些细胞信号通路与细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡等密切相关,因此,FOXC1已成为肿瘤发病机制研究的热点。微小染色体维持蛋白2(minichromosomemai n-tenance proteins 2,MCM2)是细胞增殖活性判断的新指标,用来反映细胞增殖状态时能表现出更强的特异性及敏感性。基质金属蛋白酶9(matrix metallopro teinase,MMP9)作为细胞外基质降解的主要蛋白水解酶,与肿瘤细胞侵袭、转移相关的细胞外基质降解密切相关。因此当EOC中的肿瘤细胞发生增殖及侵袭等生物学行为时在分子水平常常能够检测到MCM2、MMP9的改变。近年来有报道称,在卵巢肿瘤组织中,FOXC1在良性上皮性卵巢肿瘤的表达率为84%,在上皮性卵巢癌中的表达率为37.5%。本课题组前期研究也发现,上皮性卵巢癌组织中的FOXC1 mRNA表达量较交界性卵巢上皮性肿瘤组织及良性卵巢上皮性肿瘤组织中减少,且FOXC1在组织中的mRNA表达量与淋巴结转移相关,提示FOXC1在组织中表达的缺失可能对上皮性卵巢癌的发生发展有重要意义。然而,FOXC1的异常表达能否引起上皮性卵巢癌细胞生物学功能的改变,如何参与EOC的发生发展尚不清楚。另外,大量研究显示,在EOC中NF-κB信号传导通路可以参与MCM2、MMP9的调控。因此,本课题将对FOXC1是否参与了上皮性卵巢癌细胞的恶性生物学行为,是否能通过NF-κB信号通路对其调控进行初步探讨。目的通过慢病毒感染方式在上皮性卵巢癌细胞SKOV3中构建FOXC1过表达及干扰稳定细胞株后,探讨FOXC1对SKOV3细胞增殖及侵袭能力的影响,并初步判断FOXC1是否可以通过激活NF-κB信号通路对其进行调控,分析EOC中FOXC1异常表达所扮演的角色。材料和方法1研究对象及分组本研究选用人上皮性卵巢癌细胞系SKOV3细胞(第四军医大学病原生物学教研室赵亚教授馈赠),应用RPMI-1640完全培养基,将细胞置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养。实验分组:实验组(FOXC1 Overexpress组、FOXC1shRNA组),载体对照组(Overexpress Control组、shRNA Control组)及空白对照组(Control组)。2实验方法在上皮性卵巢癌SKOV3细胞中分别感染慢病毒FOXC1 shRNA、FOXC1慢病毒载体过表达质粒,构建稳定细胞株后分别在mRNA和蛋白水平进行验证。应用CCK-8实验、Transwell实验,分别观察SKOV3细胞的增殖、侵袭能力的变化;通过qRT-PCR法检测比较各组MCM2、MMP9的mRNA水平的变化;采用Western blot法检测各组MCM2、MMP9、NF-κB p65、NF-κB p-p65的蛋白表达水平情况。3统计学处理采用SPSS21.0软件进行统计学分析。实验数据均以x±s表示,各组间数据的比较,正态分布的采用单因素方差分析和独立样本的t检验。偏态分布的计量资料各组间比较采用Kruskal-Wallis检验和秩和检验。检验水准α=0.05。结果1稳定株构建及鉴定情况经qRT-PCR筛选鉴定3条FOXC1干扰序列,FOXC1 shRNA1抑制效果最佳,选取该序列,通过感染及嘌呤霉素筛选后,应用Western blot验证,结果显示实验组FOXC1蛋白表达量较载体对照组及空白对照组明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。在SKOV3细胞中成功构建了FOXC1干扰稳定株。应用FOXC1慢病毒载体过表达质粒成功感染SKOV3细胞,经嘌呤霉素筛选,通过qRT-PCR和Western blot验证,实验组中FOXC1在mRNA的表达水平及蛋白水平均明显高于2组对照组,且差异有统计学意义(P<0.05)。成功获得稳定过表达FOXC1的SKOV3细胞株。2 FOXC1对SKOV3细胞增殖、侵袭能力的影响情况2.1 FOXC1对各组SKOV3细胞增殖的影响情况通过CCK-8检测SKOV3细胞增殖能力结果显示:0h各组细胞吸光度值无差异。下调FOXC1组SKOV3细胞的增殖活性高于2组对照组,尤其48h后增殖活性明显增高,经统计学分析,差异均有统计学意义(P<0.05)。当上调FOXC1后,SKOV3细胞的增殖活性较2组对照组降低,且差异具有统计学意义(P<0.05)。2.2 FOXC1对各组SKOV3细胞侵袭能力的影响情况各组SKOV3细胞种板24h后,在光镜下计数各组细胞穿膜数,下调FOXC1组穿膜数较2组对照组相比明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05)。上调FOXC1组与2组对照组相比细胞穿膜数明显减少,且差异具有统计学意义(P<0.001)。3 FOXC1各组细胞MMP9、MCM2的mRNA和蛋白的表达情况3.1干扰FOXC1后SKOV3细胞中MMP9、MCM2的mRNA及蛋白水平变化情况经qRT-PCR检测,结果显示:下调FOXC1组的SKOV3细胞与2组对照组相比,MMP9、MCM2的mRNA表达量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。应用Western blot检测显示:下调FOXC1组的SKOV3细胞与2组对照组相比,MCM2的蛋白水平表达量增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.2过表达FOXC1后SKOV3细胞中MMP9、MCM2的mRNA及蛋白水平变化情况经qRT-PCR检测,上调FOXC1组的SKOV3细胞较2组对照组相比MMP9、MCM2的mRNA表达量减少,差异均有统计学意义(P<0.05)。经Western blot检测,结果显示:上调FOXC1组的SKOV3细胞中MMP9、MCM2的蛋白表达量较2组对照组相比明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。4 FOXC1各组细胞p65、p-p65的蛋白表达情况4.1干扰FOXC1后SKOV3细胞中p65、p-p65蛋白水平变化情况经Western blot检测,结果显示,下调FOXC1组的SKOV3细胞中p65的蛋白表达量较2组对照组相比有所增多,但差异无统计学意义(P>0.05)。下调FOXC1组中p-p65的蛋白表达量较2组对照组明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.2过表达FOXC1后SKOV3细胞中p65、p-p65蛋白水平变化情况经Western blot检测,结果显示:SKOV3细胞中上调FOXC1组p65的蛋白表达量较2组对照组降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。上调FOXC1组p-p65的蛋白表达量较2组对照组明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论分别成功构建了FOXC1干扰及过表达SKOV3细胞稳定株。在上皮性卵巢癌SKOV3细胞中,下调FOXC1能够促进肿瘤细胞的增殖侵袭能力,上调FOX C1能够抑制肿瘤细胞的增殖侵袭能力。FOXC1可能是通过激活NF-κB信号传导通路实现对上皮性卵巢肿瘤细胞生物学功能的调控,在一定程度上参与卵巢癌的发生发展。