背景:肝细胞癌是一种常见的恶性肿瘤,其死亡率位居全球肿瘤死亡的第二名,死亡的重要因素是肝癌的高转移率和肿瘤的高侵袭性。手术切除、免疫治疗、动脉栓塞、放化疗等均是目前治疗肝癌的方式,但病人总体预后仍然较差。因此,探讨肝癌发生发展的机制,发现更为有效的方式阻止肝癌的转移和侵袭,是降低肝癌死亡的重要途径。上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是上皮细胞经过生化改变呈现间质细胞表型的过程,上皮细胞失去其典型的细胞间连接,重塑细胞骨架,并在EMT期间成为成纤维细胞,导致细胞凋亡抗性和增强的运动能力。EMT在肿瘤细胞的侵袭,增殖和迁移中起重要作用,抑制EMT可以有效抑制肿瘤细胞的转移,因此,研究肝癌细胞中EMT的发生发展机制可以为抑制肝癌的转移提供有效的解决方式。肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs)也称为癌症起始细胞,是一类具有细胞永生化能力、分化潜能和致瘤能力的细胞,它与肿瘤的转移、复发和对常规抗癌疗法的抗性密切相关。虽然在多种实体肿瘤中发现了有CSCs的存在,但其在肿瘤中的具体作用机制仍有很多的不明之处,因此,更好地了解CSCs的生物学将揭示早期诊断肿瘤的新策略,更有效地治疗它们,并防止它们复发。SPARC(secreted protein acidic and rich in cysteine),又称骨连接蛋白,它是一种基质糖蛋白,在肿瘤细胞迁移、增殖、血管生成、基质细胞粘附和组织重塑中发挥重要作用。据报道,SPARC在高转移性肿瘤中起着促癌的作用,基质SPARC的表达与预后不良也有着很大关系。尽管许多研究已经评估了SPARC表达的重要性,但其在肝癌中具体的调控作用仍不清楚。因此,研究SPARC对肝癌发生发展的调控作用具有重要意义,而且能够为肝癌的治疗提供有效的方式及更好的预后。第一部分SPARC对肝癌干细胞表型获得的调控作用目的:1.利用无血清干细胞培养基富集肝癌干细胞,比较SPARC在肝癌干细胞和非干性肝癌细胞中的表达差异。2.探讨过表达SPARC对肝癌干细胞表型获得的调控作用。方法:1.用无血清干细胞培养基悬浮培养MHCC-97H和SMMC-7721肝癌细胞,用qPCR、Western blot检测富集的细胞球和非干性肝癌细胞中SPARC的表达量。2.利用慢病毒载体构建SPARC/SPARC-NC稳定过表达细胞株,qPCR、Western blot检测转染效率,利用qPCR、Western blot及流式细胞仪检测肝癌干细胞标志物CD133、Oct4的表达差异;利用成球实验检验两组细胞的成球能力。结果:1.无血清干细胞培养基悬浮培养细胞2周后,可见培养基中细胞球形成,细胞球中SPARC的表达量高于普通贴壁细胞。2.相对于对照组,过表达SPARC后肝癌干细胞中CD133、Oct4表达量增加,流式细胞检测SPARC过表达细胞中CD133+比例明显高于对照组;荧光显微镜下可见SPARC过表达细胞的成球能力明显升高。结论:SPARC可以促进肝癌干细胞表型的获得。第二部分SPARC对肝癌细胞EMT的调控作用目的:研究过表达SPARC对肝癌细胞EMT的调控作用方法:1.利用慢病毒载体构建SPARC稳定过表达MHCC-97H、SMMC-7721、Huh-7肝癌细胞株,用qPCR、Western blot检测EMT相关基因E-cadherin、N-cadherin、vimentin表达差异。2.利用Tanswell小室迁移实验检验过表达SPARC后肝癌细胞的迁移能力差异。3.利用划痕实验检验过表达SPARC后肝癌细胞划痕修复能力的差异。结果:1.相对于对照组,SPARC过表达组中E-cadherin的表达量降低,N-cadherin、vimentin的表达量增高。2.过表达SPARC后肝癌细胞的迁移能力明显增加。3.过表达SPARC后肝癌细胞的划痕修复能力明显增强。结论:过表达SPARC促进肝癌细胞EMT的发生。第三部分SPARC对肿瘤生长的影响作用目的:研究SPARC对肿瘤生长的影响方法:1.制备SPARC过表达和对照组肝癌细胞悬液,等量注射于裸鼠腋下,观察两组裸鼠皮下成瘤的速度和大小。2.提取裸鼠皮下瘤组织,用qPCR、Western blot检测肿瘤组织中E-cadherin、N-cadherin、vimentin的表达差异。结果:1.SPARC过表达组的裸鼠皮下肿瘤生长速度明显较快,肿瘤体积明显大于对照组肿瘤。2.相对于对照组,SPARC过表达肿瘤组织中E-cadherin的表达量降低,N-cadherin、vimentin的表达量增高。结论:SPARC有促进肿瘤生长的作用