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芽胞杆菌以其在植物体内、根际、土壤等自然环境中广泛存在,能够产生抗逆的芽胞、多样的抗菌代谢产物,能够有效地定殖在植物体内并保护植物免受病原菌侵染,被认为是一种环境友好型、应用前景广的生防细菌。解淀粉芽胞杆菌是其中一类具有生防潜力的细菌,已经成功应用于多种植物采后病害的防治。苹果轮纹病(Botryosphaeria dothidea)是苹果采后重要病害之一,在中国苹果园区普遍发生。本研究首次以苹果轮纹病为靶标,以生防解淀粉芽胞杆菌PG12(B.amyloliquefaciens PG12)为研究对象,为了揭示PG12防治苹果轮纹病的主要生防机制,利用分析化学和分子生物学手段探究其主要抑菌活性物质,以及该活性物质对定殖相关的多细胞行为的影响,为苹果轮纹病生物农药的开发提供重要的理论指导。1)5. amyloliquefaciens PG12是一株对苹果轮纹病有良好生防效果的菌株。B. amyloliquefaciens PG12在苹果果实上对苹果轮纹病菌丝和孢子的抑制效果显著。无论在采前还是采后施用,B. amyloliquefaciens PG12在一定的储藏期内能够减小苹果采后病害的发生。在平板拮抗试验中,B. amyloliquefaciens PG12对苹果轮纹病菌丝生长有明显抑制作用,产生显著的抑菌圈。通过扫描电子显微镜(scanning electronic micrographs, SEM)观察发现,靠近抑菌圈的真菌菌丝畸形,初步推测PG12可能通过产生一些抗菌代谢产物抑制真菌生长。2)脂肽类抗生素是B. amyloliquefaciensPG12抗苹果轮纹病主要的抑菌活性物质。为进一步阐明B. amyloliquefaciens PG12对苹果轮纹病的主要生防机制,以抗菌代谢产物为切入点,深入探究代谢产物的抑菌活性。PG12无菌上清液中抑菌活性物质在紫外线、蛋白酶K、高温、强酸碱条件下较稳定。进一步研究发现,理化性质稳定的脂肽类抗生素是B.amyloliquefaciens PG12抑制苹果轮纹病菌菌丝和孢子的主要抗菌活性物质。经PCR检测,在B.amyloliquefaciens PG12基因组上含有脂肽家族伊枯草素、丰原素和表面活性素的关键合成基因。采用薄层层析(thin layer chromatography, TLC)-生物自显影技术分离脂肽粗提物,发现有两种脂肽类抗生素家族的化合物对苹果轮纹病有显著地抑制作用,分别为伊枯草素和丰原素。利用反相高效液相色潜(reversed-phase high-performance liquid chromatography, RP-HPLC)和电喷射离子化四级飞行时间质谱/质谱(ESI-Q-TOF MS/MS)进一步纯化和分析得到其中伊枯草素家族的活性物质为伊枯草素A,分子量为1043.55 m/z。为了从分子生物学角度进一步确证脂肽类抗生素的抑菌作用,在已有文献的基础上找到了一种适于B. amyloliquefaciens PG12的遗传操作方法,并适用于其他解淀粉芽胞杆菌野生型菌株。通过同源重组构建了脂肽类抗生素合成相关基因的单、双和三基因敲除突变体,它们分别丧失一种、两种和三种脂肽类抗生素的合成能力,无法合成表面活性素、伊枯草素A和丰原素的突变体显著降低B. amyloliquefaciens PG12对苹果轮纹病的抑制作用。伊枯草素A和丰原素的抑菌作用强于表面活性素,且伊枯草素A和丰原素两种脂肽类抗生素具有协同增效作用。3)脂肽类抗生素不同程度地促进B. amyloliquefaciens PG12定殖相关的多细胞行为。近年来一些研究发现脂肽类抗生素能够影响枯草芽胞杆菌除抑菌活性外的其他一些生物学特性,如生物膜形成、运动性等与定殖相关的多细胞行为。为了探究解淀粉芽胞杆菌所产生的脂肽类抗生素是否也有上述的生物学特性,本研究进一步分析了B. amyloliquefaciens PG12脂肽类抗生素对其多细胞行为的影响。表面活性素、伊枯草素A和丰原素均不同程度的促进了B.amyloliquefaciens PG12薄皮型和菌落生物膜的形成。表面活性素对整个生物膜形成都有显著影响,同时首次发现伊枯草素A和丰原素对解淀粉芽胞杆菌生物膜形成初期的影响较后期显著。表面活性素、伊枯草素A和丰原素均促进B. amyloliquefaciens PG12群集和游动的运动性能,其中伊枯草素A和丰原素在游动性能中的贡献不同于表面活性素,首次证明了伊枯草素家族的伊枯草素A显著影响解淀粉芽胞杆菌的运动性。最后,采后果实生测试验进一步证明脂肽类抗生素合成能力的丧失显著影响B. amyloliquefaciens PG12在一定储藏期内对苹果轮纹病发挥生防作用。总而言之,脂肽类抗生素是B. amyloliquefaciens PG12具有良好生防效果的重要因素,该生防效果是脂肽类抗生素对真菌的拮抗作用、对芽胞杆菌多细胞行为等定殖相关性状的促进作用等生物学功能综合作用的结果。