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研究背景:冠状动脉性心脏病(coronary artery disease,CAD)是各国家及地区人群死亡和残疾的主要原因之一。在35岁以上人群中,CAD所致死亡人数占总死亡人数的约1/3以上。冠心病的经典治疗方法包括药物治疗、经皮冠脉动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)及冠状动脉旁路移植术(coronary artery bypass graft surgery,CABG),但仍有部分患者在行PCI(或CABG术)治疗后未获得完全再血管化或最大剂量药物治疗后心绞痛症状仍然反复出现,或处于冠心病终末期而失去手术机会。据近期调查结果显示难治性心绞痛(refractory angina,RFA)年死亡人数占总死亡人数约3-4%。多项临床试验提示体外心脏震波治疗(cardiac shock wave therapy,CSWT)作为一种新型的无创的治疗方式在缓解心绞痛症状,提高生活质量等方面起到显著作用。体内外实验研究表明震波治疗(shock wave therapy,SWT)可以促进缺血心肌血管新生,调节血管扩张,抑制心肌细胞凋亡及促进自噬。程序性坏死(necroptosis)是近年来新发现的由死亡受体介导的半胱天冬酶(caspase)非依赖性的细胞死亡形式。越来越多的研究表明程序性坏死在炎症反应、缺血性损伤等多种病理过程中具有重要意义。程序性坏死在心肌缺血缺氧再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)中的研究倍受关注。但在 MIRI 后,CSWT能否通过调控心肌细胞的程序性坏死而对心肌细胞起到保护作用,目前国内外尚未见报道。研究目的:选用小鼠心肌细胞系HL-1作为研究对象。1.建立合适的心肌细胞体外缺氧复氧(hypoxia-reoxygenation,H/R)模型,探讨H/R后心肌细胞程序性坏死、自噬及凋亡水平的变化情况。2.予中等级别能量的SWT处理缺氧复氧的心肌细胞,检测SWT对心肌细胞程序性坏死、自噬及凋亡水平的影响。3.探讨SWT调节H/R模型中心肌细胞程序性细胞坏死的可能机制。研究方法:1.予HL-1心肌细胞不含FBS的RPMI1640培养基同步化处理24小时后,将培养基更换为缺氧模拟缓冲液,于含有94%N2、5%CO2和1%O2(v/v/v)的三气缺氧培养箱中培养3-8小时后,继续于常氧培养箱中培养12小时,予MTS法测定细胞活力;乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)检测判断细胞损伤程度;Western Blot(WB)法检测微管相关蛋白轻链3(microtubule associated protein Light Chain 3,LC3B)、Beclin1、受体相互作用蛋白激酶 1(Receptor-Interacting Protein Kinase 1,RIPK1)及RIPK3蛋白表达水平以评价自噬及程序性坏死水平。选择中等强度细胞损伤且自噬及程序性坏死均较明显时为最佳H/R模型。2.将HL-1心肌细胞随机分为正常对照组(normal control,NC)、NC+SWT(SWT能量级别为0.05mJ/mm2)、H/R组及H/R+SWT组,运用WB法测定程序性坏死信号通路相关蛋白(RIPK1、RIPK3),自噬信号通路相关蛋白(Beclin-1、LC3B、p62、AMPK及p-AMPK),凋亡信号通路相关蛋白(cleaved caspase-3、Bax及Bcl2),细胞存活相关蛋白(p-Akt、Akt)及磷酸化-p38MAPK/p38MAPK表达水平;予Annexin V-FITC/PI流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测心肌细胞凋亡及坏死水平;予二氢乙啶(Dihydroethidium,DHE)染色法检测细胞内活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)生成;予硫代巴比妥酸(thiobarbituricacid,TBA)法检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平;予单丹磺酰尸胺(Monodansylcadaverin,MDC)法检测自噬小体形成;予LC3双标腺病毒法检测自噬流变化。3.予不同浓度(0,2.5mmol/L,3.75mmol/L,5mmol/L,7.5mmol/L)的自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)预处理HL-1细胞后行H/R和SWT,予MTS法测定细胞活力;予WB法检测LC3B和Beclin1表达水平,根据自噬抑制效率选择合适浓度的3-MA。将HL-1细胞随机分为H/R组、H/R+SWT组、H/R+3-MA组及H/R+3-MA+SWT组,予WB法检测LC3B、Beclin1、p62、RIPK1、RIPK3、Bax及Bcl2蛋白的表达水平;予FCM法检测细胞凋亡及坏死水平;MTS法检测细胞活力。研究结果:1.H/R后心肌细胞的活力随着缺氧时间延长而逐渐降低,缺氧5小时复氧12小时,细胞活力下降 28.4±2.4%,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1、RIPK1、RIPK3 表达均明显升高(p<0.05),选用此水平作为H/R模型的标准。2.中等级别能量的SWT(0.05mJ/mm2)可使H/R组的细胞活力提高约15.4%,H/R+SWT 组中 RIPK1、RIPK3、cleaved caspase-3、Bax/Bcl2、Beclin1 及 p62 表达水平较H/R组均明显下降(p<0.05),且LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著下降;而细胞存活相关蛋白p-Akt/Akt表达显著升高(p<0.05)。NC组的细胞活力及相关蛋白表达在SWT后未见明显变化(p>0.05)。FCM法检测细胞凋亡及坏死情况,结果显示NC组、H/R组、H/R+SWT组凋亡比例分别为2.16±0.61%、16.73±0.77%、13.1±1.1%,坏死比例分别为 3.55±1.12%、21.63±0.61%、15.8±2.0%。3.ROS检测结果显示SWT可以明显下调H/R诱导的心肌细胞ROS生成(p<0.05)。MDA检测结果显示与NC组相比,H/R组MDA水平升高约1.8倍(H/R组vs NC 组 3.0±0.3 nmol/mg prot vs 1.1±0.1 nmol/mg prot);予 H/R 组心肌细胞 SWT后,MDA 水平降低约 29%(H/R 组 vs H/R+SWT 组 3.0±0.3 nmol/mg prot vs 2.2±0.2nmol/mgprot)。同时,WB检测结果显示SWT可明显下调H/R诱导的p-p38/p38 的升高(p<0.05)。4.MDC染色结果显示与NC组相比,H/R组心肌细胞内自噬小体生成数目明显增多(p<0.05),SWT可显著抑制H/R组中自噬小体的生成(p<0.05)。5.自噬流检测结果示H/R诱导心肌细胞自噬小体生成增多,自噬溶酶体较少;SWT可促进H/R后细胞内自噬小体减少,自噬溶酶体形成明显增多。6.H/R后心肌细胞LC3-Ⅱ/LC3-I及Beclin1表达水平降低呈3-MA效量依赖性。MTS检测示3-MA浓度为7.5mmol/L时,心肌细胞活力明显降低,因此我们将3-MA合适浓度定为5mmol/L。与H/R组相比,H/R+3-MA组心肌细胞的RIPK1、RIPK3、p62及Beclin1蛋白表达水平均明显下降,而Bax/Bcl2显著升高(p<0.05)。FCM检测结果示与H/R组相比,H/R+3-MA组细胞凋亡率明显升高(H/R组vs H/R+3-MA 组 16.7±0.8%vs 22.5%±0.9%),细胞坏死率显著降低(H/R 组 vs H/R+3-MA 组 21.6%±0.6%vs 11.8%±0.9%)。与 H/R+3-MA 组相比,H/R+3-MA+SWT组心肌细胞活力未见进一步升高(p>0.05),蛋白表达、细胞凋亡及坏死水平亦未见明显变化(p>0.05)。研究结论:1.H/R可提高心肌细胞内氧化应激水平,诱导心肌细胞发生程序性细胞坏死、自噬及凋亡,促进心肌细胞损伤,降低心肌细胞活力。2.SWT可抑制H/R诱导的心肌细胞程序性坏死和凋亡,减少心肌细胞损伤,提高H/R后心肌细胞活力。3.SWT可通过缓解H/R后的自噬流阻滞,抑制程序性坏死的发生。