目的:本课题为国家自然科学基金资助项目(81603119)、北京市自然科学基金资助项目(7174316)的主要研究内容。盐酸小檗碱又名黄连素,其化学分子式为[C20H18NO4]+Cl-,属于异喹啉类生物碱,具有强的抗菌能力和广泛的抗菌谱。然而临床上抗生素的广泛使用一直在加速耐药菌的产生,特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicilin-resistant Staphylococcus,MRSA)。MRSA多重耐药的特点为临床治疗带来了巨大的挑战。之前有研究报道细菌的胞外基质中酚溶调制肽(phenol-soluble modulins,PSMs)是导致葡萄球菌致病性的主要毒力因子。该毒力因子的作用机制为PSMs多肽聚集形成细菌淀粉样纤维,PSMs进一步调控细菌生物膜的形成及释放,加重机体炎症损伤,进而保护细菌免受机体免疫系统的攻击,并赋予细菌强大的致病力。本实验从MRSA的耐药机制着手,研究对象为盐酸小檗碱与MRSA的生物膜、PSMs多肽以及PSMs单体的相互作用,进而探讨盐酸小檗碱通过干扰或阻断PSMs多肽聚合形成淀粉样纤维、抑制其发展形成生物膜发挥的生物学功能、降低炎症损伤的可行性,为临床治疗MRSA感染提供有效的思路和手段。材料与方法1.材料:实验用盐酸小檗碱购自Sigma公司,使用时用超纯水配制,超净台内无菌操作,分装冻存。耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA-ATCC33591)为本实验室冻存于-80℃冰箱中的菌株,用时取出。2.方法:(1)本研究绘制了MRSA-ATCC33591的生长曲线,采用抑菌环实验验证不同浓度盐酸小檗碱对MRSA-ATCC33591在营养肉汤中生长情况的影响。对比阳性对照观察其抑菌性。(2)采用激光共聚焦显微镜观察MRSA生物膜在不同浓度盐酸小檗碱条件下的完整性,分析盐酸小檗碱对生物膜完整性的影响,探讨盐酸小檗碱对MRSA生物膜形成的作用。(3)采用刚果红染色观察盐酸小檗碱对MRSA生物膜中淀粉样纤维形成的影响,采用透射电镜观察不同浓度盐酸小檗碱条件下MRSA生物膜中胞外淀粉样纤维的形态,研究盐酸小檗碱对MRSA生物膜中淀粉样纤维形成的影响。(4)采用Gromos 96(53A6)力场以及Gromacs 4.5软件,利用分子动力学模拟技术研究盐酸小檗碱和PSM单体之间的相互作用。(5)建立DSS诱导的小鼠急性结肠炎炎症模型,观测盐酸小檗碱对化学致炎剂导致的炎症损伤中的作用。(6)建立MRSA感染的小鼠皮肤脓肿炎症模型,观测盐酸小檗碱对MRSA或PSMs导致炎症损伤的作用,从而明确盐酸小檗碱在MRSA致病中的抗炎作用。结果:1.通过抑菌环实验及分光光度计法,验证了盐酸小檗碱在低浓度时不能直接杀死细菌,超过阈值时具有浓度依赖性的抑制细菌生长的特性。2.激光共聚焦显微镜观察结果显示盐酸小檗碱能够破坏MRSA生物膜的连续性。3.刚果红染色实验提示盐酸小檗碱能够抑制细菌胞外淀粉样肽的形成,进而干扰生物膜的形成及稳定性。4.透射电镜观察揭示了盐酸小檗碱对MRSA淀粉样纤维形成的抑制作用,阻碍PSM单体释放及PSMs多肽聚集形成淀粉样纤维,影响生物膜形成。5.分子动力学模拟表明盐酸小檗碱与MRSA分泌的淀粉样纤维单体PSM-α2的结合是通过疏水性作用结合在PSM-α2苯环上的。6.小鼠的溃疡性结肠炎模型试验表明盐酸小檗碱对化学致炎剂诱导的炎症性肠病的形成具有一定的干预作用。7.小鼠的皮肤脓肿模型实验表明盐酸小檗碱对体内耐药菌引起的感染具有较好的治疗效果,并对其可能的作用机制进行了阐述。结论:1.本课题采用抑菌环实验和激光共聚焦显微镜观察结果分析得出盐酸小檗碱对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌的抑制作用不是通过直接杀灭细菌而是通过破坏生物膜的完整性来抑制细菌生长。2.刚果红染色实验和透射电镜结果表明盐酸小檗碱能够通过抑制耐药菌生物膜中淀粉样纤维形成来破坏稳定性生物膜的形成。3.盐酸小檗碱和PSM单体之间动力学模拟表明盐酸小檗碱与PSM单体的结合是通过疏水性相互作用实现的。4.动物模型显示盐酸小檗碱对MRSA-ATCC33591引起的皮肤脓肿模型具有一定的干预效果,说明盐酸小檗碱具有体内的抑菌抗炎作用。5.盐酸小檗碱可以与MRSA分泌的PSMs多肽进行相互作用,进而影响PSMs多肽聚合形成生物膜,明确盐酸小檗碱在抑制MRSA感染中的作用机制。