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猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是引起母猪繁殖障碍性疾病重要病原,能够引起初孕母猪流产、产死胎、畸胎和木乃伊胎等,给养猪业造成了巨大的经济损失。PPV基因组主要包括2个开放性阅读框(Open Reading Frame,ORF)ORF1和ORF2,ORF1主要编码非结构蛋白NS1和NS2,它们的功能是参与病毒复制及致细胞病变。NS2具有与NS1相同的N末端,且NS2-m RNA是由NS1-m RNA(pre-m RNA,NS2-m RNA的前体m RNA)经可变剪接之后产生。宿主蛋白Syncrip是核不均一核糖核蛋白(Heterogenous nuclear ribonucleo proteins,hn RNPs)家族成员之一,与宿主细胞m RNA的转录、外显子剪接以及剪接位点的选择等过程相关,此外还参与了某些肝炎病毒的复制。ORF2主要编码结构蛋白VP1和VP2,VP2是PPV最主要的衣壳蛋白,占衣壳成分的80%左右,在病毒感染过程中VP2参与了病毒基因组的入核和成熟病毒粒子的组装。宿主蛋白MCM3是解旋酶MCM家族成员之一,在宿主DNA复制过程中能够使双链DNA发生解旋从而促进宿主细胞DNA的复制。然而,在PPV复制过程中宿主蛋白Syncrip和MCM3有何作用及其作用机制,迄今尚未见报道。本论文首先构建编码NS1和NS2共有基因序列的大肠杆菌表达载体,制备能同时识别出NS1和NS2的多克隆抗体。通过无缝克隆技术(In-Fusion)构建稳定携带遗传标记的PPV全长感染性克隆株。然后,利用蛋白-蛋白免疫共沉淀(Co-IP)以及RNA-蛋白免疫共沉淀(RNA-pulldown)串联质谱技术分别筛选出NS1-m RNA和VP2关键宿主互作蛋白Syncrip和MCM3。最后,研究宿主互作蛋白Syncrip和MCM3在PPV复制过程中的作用及机制,为进一步探索PPV致病机制奠定理论基础。研究取得以下结果。1.PCR扩增出编码NS1和NS2共有的ns基因,将扩增出的ns基因克隆入原核表达载体p ET-32a,PCR、酶切和测序鉴定结果显示,p ET-32a-NS原核表达载体构建成功。将p ET-32a-NS转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行诱导表达,SDS-PAGE和western blotting结果显示,重组质粒在大肠杆菌中成功表达出大小为35 k Da左右的NS重组蛋白,并且该重组蛋白在上清和包涵体中均有表达。对重组菌可溶性表达的最佳条件进行优化,结果显示,重组菌在37℃,0.8 m M诱导剂诱导6 h时的可溶性表达量最高。在最佳条件下大量诱导表达重组蛋白,通过His镍柱纯化出NS重组蛋白。将纯化的重组蛋白免疫小鼠制备抗NS蛋白血清抗体,ELISA检测抗体效价为1:12800,western blotting检测结果显示,该抗体能够特异性识别原核表达NS重组蛋白以及真核细胞表达的NS1和NS2。2.人工合成基因组两端的特殊回文序列F1和F2,构建含F1和F2序列的质粒p KQLL(F1+F2)。以提取的PPV DN A为模板,分别扩增F3和F4片段,与线性化处理的质粒p KQLL(F1+F2)进行无缝克隆(In-fusion)连接,构建携带遗传标记的PPV全长感染性克隆质粒p Y-PPV,将p Y-PPV质粒转染PK-15细胞,连续盲传进行病毒拯救。提取被感染细胞的DNA进行病毒核酸PCR检测呈阳性,在电镜下观察到了病毒粒子,western blotting和间接免疫荧光(IFA)检测到病毒蛋白的表达,并且连续盲传至15代仍然能检测到病毒所携带的遗传标记。以上结果表明,成功拯救出稳定携带遗传标记的PPV感染性克隆株,命名为Y-PPV株。将Y-PPV和亲本毒株PPV按照相同MOI接种PK-15细胞,通过测定感染后不同时间点病毒DNA拷贝数和TCID50,检测Y-PPV和亲本毒株PPV的复制能力。同时通过AO-EB染色、流式细胞术及caspase活性检测Y-PPV和PPV诱导细胞凋亡的特性。结果显示,Y-PPV的复制能力与亲本毒株相比无显著差异(p>0.05),同时具备与亲本毒株相似的诱导细胞凋亡特性。进一步将Y-PPV和PPV分别感染初孕母猪,ELISA检测到Y-PPV和PPV感染组初孕母猪血清中PPV抗体水平变化趋势一致且各时间点的PPV抗体水平无明显差异(p>0.05),放射免疫检测结果显示,Y-PPV和PPV感染组初孕母猪血清中的孕酮水平变化趋势一致且各时间点的孕酮水平无明显差异(p>0.05)。通过Real-time PCR检测到Y-PPV和PPV感染的同一组织中病毒载量无明显差异(p>0.05)。病理组织学检查结果显示,Y-PPV和PPV感染均能够使子宫和卵巢组织出现明显病理学损伤。3.筛选鉴定NS1-m RNA的关键宿主互作蛋白。体外合成生物素标记NS1-m RNA,将其与PK-15细胞核抽提物共孵育,以链霉亲和素磁珠筛选共沉淀蛋白并进行质谱分析,筛选出与NS1-m RNA互作的关键宿主蛋白Syncrip。将生物素标记NS1-m RNA和PK-15细胞核抽提物共孵育,RNA-pulldown检测结果显示,NS1-m RNA和Syncrip存在互作。用Syncrip抗体和PPV感染的PK-15细胞核抽提物共孵育进行蛋白质-RNA免疫共沉淀,结果显示,NS1-m RNA和Syncrip存在互作。在PPV感染PK-15细胞后进行原位杂交,通过激光共聚焦检测结果显示,NS1-m RNA和Syncrip存在共定位。将生物素标记NS1-m RNA和纯化后原核表达的Syncrip进行体外互作试验,凝胶迁移结果显示,NS1-m RNA和Syncrip存在直接互作。4.明确Syncrip在PPV感染过程中的作用及机制。利用syncrip的si RNA处理PK-15细胞后,测定PPV感染细胞上清中的病毒DNA拷贝数和TCID50。结果显示,干扰syncrip的表达能够降低PPV感染过程中的病毒DNA拷贝数和TCID50(p<0.05)。通过CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建了syncrip敲除细胞株,检测结果显示,该细胞株的细胞活力和野生型PK-15细胞相比无明显差异(p>0.05)。PPV感染syncrip敲除细胞后发现,syncrip的缺失能够显著降低PPV感染后的DNA拷贝数和TCID50(p<0.05),并且也能够显著降低NS2的蛋白表达水平和m RNA水平(p<0.05)。同时在Y-PPV平台上构建ns2缺失型毒株,细胞试验结果显示,ns2缺失能够显著降低PPV感染过程中的病毒DNA拷贝数和TCID50(p<0.05)。利用Real-time PCR和western blotting检测到PPV在组织中的复制水平与Syncrip表达水平呈正相关。在体外共转染ns1和syncrip,western blotting和Real-time PCR结果显示,过表达Syncrip能够显著降低NS1的蛋白表达和m RNA表达水平(p<0.05)。在体外共转染ns1上ns2的3’末端的剪接位点突变的Flag-NS1(p C-Mut)和Syncrip,western blotting结果显示,过表达Syncrip对NS1的蛋白表达无明显影响(p>0.05)。5.筛选鉴定VP2的关键宿主互作蛋白。收集PPV感染PK-15细胞后的细胞蛋白,以PPV衣壳蛋白3C9抗体进行免疫共沉淀和质谱分析,筛选出VP2的关键宿主互作蛋白MCM3。将p CI-His-VP2和p CI-Flag-MCM3共转至HEK293T细胞,Co-IP发现VP2和MCM3存在互作。将p CI-His-VP2和p CI-Flag-MCM3质粒共转染或病毒感染PK-15细胞后进行免疫荧光染色分析,在激光共聚焦显微镜下观察到外源性及内源性的VP2和MCM3存在明显共定位现象。进一步在大肠杆菌中分别表达p ET-32a-VP2和p GEX-4T-MCM3蛋白并进行纯化,通过GST-pulldown及His-pulldown均能够检测到VP2和MCM3的互作,并且二者的互作不依赖于PPV感染或其它分子的参与。6.明确VP2及MCM3在PPV复制过程中的作用与机制。用vp2基因si RNA处理PK-15细胞后,测定PPV感染细胞上清中的病毒DNA拷贝数和TCID50,结果显示,干扰vp2的表达能够显著降低PPV感染后的DNA拷贝数和TCID50(p<0.05)。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建了mcm3敲除细胞株,检测发现,该细胞株的细胞活力和野生型PK-15细胞相比无明显差异(p>0.05)。细胞感染试验结果显示,mcm3的缺失能够显著降低PPV感染后的DN A拷贝数和TCID50(p<0.05)。通过Co-IP鉴定出VP2的115 aa~231 aa是和MCM3互作的关键结构域。进一步通过原位杂交方法在激光共聚焦显微镜下观察到,在PPV感染后NS1、VP2、MCM3以及病毒基因组DNA存在互作。然后通过DNA-pulldown检测到VP2、NS1和病毒基因组DNA存在直接互作关系,而MCM3不能直接和病毒基因组DNA发生互作。通过Co-IP和激光共聚焦检测到NS1不能参与招募MCM3到病毒基因组DNA,而VP2能够直接招募MCM3到病毒基因组DNA。进一步的DNA-pulldown检测到基因组DNA的300nt~356 nt是DNA与VP2互作的关键基序区域,突变该互作基序能够完全阻止PPV的复制。本研究制备了特异性强、且能够同时识别PPV非结构蛋白NS1和NS2的多克隆抗体。成功获得了一株具有遗传稳定性、能够与亲本毒株感染相区分,并且保留了和亲本毒株相似生物学特性的PPV感染性克隆株,命名为Y-PPV株。分别筛选到NS1-m RNA和VP2关键宿主互作蛋白Syncrip和MCM3,明确了NS1-m RNA和VP2与关键宿主互作蛋白Syncrip和MCM3的直接互作关系。发现了NS2和Syncrip能够参与PPV的复制过程,敲除syncrip显著降低PPV的复制以及NS2的表达,ns2的缺失同样会显著降低PPV的复制能力。Syncrip的过表达会显著降低NS1的表达,并且该作用位点位于ns1基因上ns2的3’末端的剪接位点。发现了VP2及其互作蛋白MCM3均参与了PPV的复制,PPV感染过程中通过VP2和病毒基因组DNA直接互作招募MCM3至病毒基因组的DNA促进PPV的复制,获得了VP2的115 aa~231 aa是与MCM3发生互作的关键结构域。发现了病毒基因组300 nt~356 nt是病毒基因组DNA和VP2发挥互作的关键基序,并且该关键基序对PPV复制是必需的。上述研究结果阐明了NS1-m RNA和VP2及其互作蛋白Syncrip和MCM3在PPV复制过程中的作用及机制,为进一步深入探讨PPV致病机制提供理论依据。