论文部分内容阅读
背景:佛手散(FSS)是一个中国古方,研究发现可对血虚、血瘀、中风和缺血性脑血管疾病发挥有效保护作用。越来越多的证据也表明,肠-肝-脑轴与神经系统疾病密切相关,包括阿尔茨海默病(AD)。但佛手散是否对阿尔茨海默病(AD)具有保护作用及其具体机制尚不清楚。目的:研究不同剂量FSS对APP/PS1双转基因阿尔茨海默病(AD)小鼠认知功能和脑组织病理的影响,并探讨FSS改善AD小鼠认知功能和脑组织病理是否与调节肠-肝-脑轴的肠道菌群、碱性磷酸酶(AP)和减少脂多糖(LPS)和脂质过氧化(丙二醛,MDA)有关。方法:一、动物实验本研究使用经典的APP/PS1双转基因AD小鼠模型来探索古方佛手散(FSS)的神经保护作用及其相关机制。将6、7月龄雄性APP/PS1小鼠随机分为模型(AD)组、高、中、低剂量FSS组(FSS-H、FSS-M、FSS-L)和与APP/PS1小鼠年龄匹配的C57BL/6J小鼠作为野生(WT)组。高、中、低剂量组FSS给药剂量分别为6.4g/kg/d、3.2g/kg/d和1.6g/kg/d。阳性对照组给予2mg/kg/d多奈哌齐(Donepezil),WT组和AD组给予等体积的蒸馏水。所有治疗均为胃内给药,每天一次,持续8周。给药后,采用Morris水迷宫、Y迷宫和新物体识别行为学试验检测AD小鼠认知功能。二、生化实验苏木精-伊红(HE)染色用于观察海马神经元损伤;通过免疫组织化学来分析脑海马中A β1-42和脂多糖(LPS)的水平;通过蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)检测脑中的碱性磷酸酶(AP)水平,并通过碱性磷酸酶测定试剂盒评估肝、血清和肠中碱性磷酸酶(AP)的活性水平;通过显色基质法鲎试剂盒检测肝脏、血清和粪便中的LPS水平;通过丙二醛(MDA)测定试剂盒测量肝脏、血清、肠道和脑组织中的MDA水平;通过实时定量PCR(qPCR)定量检测粪便中的大肠杆菌和乳酸杆菌拷贝数。结果:一、佛手散对APP/PS1模型小鼠认知功能的影响(1)Morris水迷宫实验结果:与正常组相比,模型小鼠的逃避潜伏期显著延长(P<0.05),而中剂量、高剂量佛手散组和多奈哌齐治疗组可显著缩短APP/PS1模型小鼠逃避潜伏期(P<0.05)。空间探索期,各组小鼠游行平均速度没有显著性差异,但模型组小鼠穿越平台次数明显少于正常组(P<0.05),及模型组在目标象限的停留时间明显低于正常组(P<0.05)。8周FSS治疗后,高剂量组和阳性对照组均显著增加穿越平台次数,也显著延长在目标象限停留时间(P<0.05或P<0.01),另外中剂量佛手散组显著延长了在目标象限停留时间(PP<0.01),低剂量组也显著增加了穿越平台次数(P<0.05)。(2)Y迷宫结果显示,佛手散(FSS)给药8周后,模型组三臂交替百分比明显小于正常组(P<0.01),给药组均提高了模型组的交替率(PP<0.05),尤其高剂量组和中剂量组(P<0.01)。(3)新的物体识别试验结果表明,正常组小鼠辨别指数显著高于模型组小鼠(P<0.05),与模型组相比,阳性药组、高、中、低剂量佛手散组自发交替的百分比没有显著性差异。(P>0.05)综上,结果提示佛手散(FSS)给药8周后,高剂量组和中剂量组可以显著改善APP/PS1双转基因AD小鼠的认知功能。二、佛手散对APP/PS1模型小鼠生化指标的影响(1)HE染色结果提示,与正常组相比,模型组小鼠的海马CA1区域中大多数神经元丢失、收缩、深染,并且外周空染和神经元纤维严重紊乱变形。与模型组相比,阳性对照组小鼠、佛手散中、高剂量组小鼠神经元损伤明显减弱。(2)免疫组化结果提示,与正常组小鼠相比,模型组小鼠海马CA1区域Aβ 1-42和LPS阳性染色面积明显增大(P<0.01),8周FSS治疗后阳性药组、佛手散高、中剂量组的A β 1-42和LPS阳性染色面积相较于模型组显著降低(P<0.05)。(3)显色基质鲎试剂盒检测结果提示,8月龄APP/PS1模型组小鼠肝、血、粪中LPS水平较正常组相比,显著升高(P<0.01);阳性药组、佛手散高剂量组小鼠肝、血、粪中LPS水平跟模型组相比,显著降低(P<0.05),佛手散中剂量组小鼠血和粪中LPS水平跟模型组相比,也显著降低(P<0.05)。(4)Western blot检测小鼠脑海马组织AP活性水平,并使用碱性磷酸酶测定试剂盒测试小鼠肠、肝和血清中的AP活性水平。结果提示,与WT组小鼠相比,AP活性在AD组小鼠脑和血清中显著升高,但肠和肝中却显著降低。经过8周FSS治疗后,佛手散高剂量组小鼠的脑和血清中以及佛手散中剂量组小鼠的血清中的AP活性低于AD组小鼠中的AP活性。相反,佛手散高剂量组小鼠和佛手散中剂量组小鼠的肠和肝中的AP活性高于AD组小鼠。(5)MDA测定试剂盒结果提示,模型组组小鼠的肠、肝、血清和脑中的MDA水平显著高于正常组小鼠的水平。然而,口服8周FSS后,除佛手散中剂量组小鼠的肠道外,佛手散中剂量小鼠和佛手散高剂量组小鼠肝脏、血清和脑中的MDA水平均显著下降。(6)实时定量PCR结果提示,与正常组相比,模型组小鼠中乳酸杆菌的拷贝数显著降低并且在中剂量和高剂量佛手散治疗后增加,模型组小鼠中大肠杆菌的拷贝数显著升高,并且在中剂量和高剂量佛手散治疗后显著下降。此外,大肠杆菌和乳杆菌的量呈负相关。(7)综上本研究经过8周连续灌胃,中、高剂量FSS(FSS-H,6.4g/kg/d;FSS-M,3.2g/kg/d)显然改善了 AD小鼠的学习认知能力,减轻了海马神经元的损伤;抑制了大脑中A β1-42和LPS的水平,降低了肝脏、血清和粪便中的LPS水平;降低了 AD小鼠大脑和血清中的AP活性,增加了 AD小鼠肠道和肝脏中的AP活性;并且显着降低了脑、肝、血清和肠中的脂质过氧化(MDA)水平;增加AD小鼠肠道中乳酸杆菌拷贝数,并减少大肠杆菌的拷贝数。结论:本研究发现APP/PS1双转基因AD小鼠肠道微生物群失调、脂多糖(LPS)水平、脂质过氧化水平和碱性磷酸酶(AP)活性水平都发生了显著变化;并发现FSS可以通过调节肠-肝-脑轴及其相关分子,如调节APP/PS1双转基因AD小鼠的肠道微生物群平衡,降低LPS水平,降低脂质过氧化水平和调节AP的活性水平来改善小鼠认知功能。因此FSS对AD小鼠的药效作用机制可能与调节肠-肝-脑轴机制有关,同时FSS很可能是未来临床上治疗阿尔茨海默病有效方剂。