背景 瘢痕疙瘩(keloid)是一种因损伤而形成以皮肤表面隆凸，变红，瘙痒为特征的良性真皮肿瘤。Keloid无自限性，可以呈蟹足样增生超过损伤边缘，侵袭到正常皮肤。瘢痕疙瘩的病因至今不明。而增生性瘢痕(Hypertrophic scar，HTS)其增生不超过皮损边缘，早期瘢痕变红、瘙痒明显，随着时间推移，呈退化趋势。尽管增生性瘢痕在生物学行为上与瘢痕疙瘩有所不同，但也有许多的相似点。如：只累及人类，病理切片上难以严格区分，许多对细胞因子的反应雷同等等。因而许多作者往往将两者一起进行某一方面的研究。由于缺乏动物模型，瘢痕疙瘩和增生性瘢痕的形成机制至今不明，其防治在临床和科研上是一个难题。 近年来，由于现代细胞分子生物学的研究手段的介入，推动了创面愈合研究的深入。临床上瘢痕疙瘩和增生性瘢痕均属于创面过度愈合。它们在组织学上表现为细胞外基质的过度积累，提示细胞外基质的变化对这两种瘢痕的生物学特征起着重要的作用。 Tenascin-C(腱抗原蛋白，简称Tn)是一个细胞外基质糖蛋白，其表达在伤口愈合过程中发生了明显的改变。Tenascins是细胞外基质中一个具有独特的六聚体结构的寡聚糖蛋白家族，至今发现有Tn-C、Tn-R、Tn-X、Tn-Y四种异构体。作为一种重要的基质成分，Tenascins不同亚型在组织中的表达、定位均有其特点。大量研究发现Tenascins与胚胎形成、肿瘤发生及损伤修复过程有关。Tn-C被认为参与了细胞的黏附与迁徙的调节机制。 在正常成人皮肤中，Tn-C表达于真皮—表皮交界处的乳头真皮，在基底膜下方呈斑点样、不连续分布甚至缺如，以及靠近基底膜的血管和表皮附件。但在皮肤损伤修复时，Tn-C的表达可以在伤后1天迅速增加，连续分布于创缘，以扩 Tenascjvi－C甚百虎厂厂和仑生烂窟窟一的f达·10·散的方式遍及基质，直到肉芽组织被重建的真皮组织替代（伤后14天）。如果出现撅痕增生，真皮的Tn｛的可维持较高表达，尤其是在瘀痕疙瘩中。在胎儿皮肤伤口，Tn－C伤后1’J＼时即出现表达增加，伤口愈合后Tn－C消失的时间比成人为早。故而推测Tn｛是导致胎儿伤后皮肤快速愈合无瘫痕的相关因素之一。 Tn－C在正常成人皮肤中局限于真皮，但在表皮增生性疾病如牛皮癣，表皮肿瘤和损伤时，Tn－C在乳头真皮的表达可以明显上调。而表皮角肮细胞被认为介导或调节了Tn－C的产生。但近来研究表明在离体和体内实验中人类伤口愈合过程中表皮角肮细胞合成Tn｛并使Tn｛在细胞外基质中沉积。角肮细胞也是Tn－C产生的来源之一。Tn－C在伤日愈合中的表达在许多动物模型的实验中被研究，然而，有关于人类伤日愈合中的表达特别是kelo巾、增生性疲痕中表达的研究非常有限。Ke i d、增生性瘟痕中表皮角肮细胞的 Tn｛基因表达未见有研究报道。Keloid、增生性瘟痕存在细胞外基质的过度沉积及表皮异常，其Tn｛基因表达、蛋白分布尚有待于深入研究。 Clll 和Ki－67分别是检测表皮异常分化，细胞增殖的指标。FN是一个非胶原的糖蛋白。在大部分的间质的结缔组织中含量丰富。可能介导了细胞和其它基质成分间的影附作用。 本实验应用地高辛标记的原位杂交技术和兔疫组织化学技术检测Tn｛在keloid、增生性疲痕表达情况，同时运用免疫组织化学技术检测FN，Ki67，CK－16在keloid、增生性疲痕中的表达情况。对于keloid、增生性瘫痕、正常皮肤组织作对照研究，观察Tn－C在三者中基因与蛋白的表达情况；分析keloid与增生性撅痕中表皮角肌细胞中产生讣｛的水平以及与细胞分化和增殖间的关系。通过进一步了解Tn｛在keloid与增生性慷痕中表达的特性，为明确其生物学功能、进一步探索keloid与增生性瘫痕的发病饥理奠定基础。材料与方法一、标本 收集2000年6月——2001年6月浙江大学医学院附属第二医院癫痕疙瘩10例，增生性疲痕＊例手术标本。正常皮肤取自整形科门诊腋臭、疙切除病人5例（排除有增主性瘫痕、痰痕疙瘩史）。标本离体后立即取材。病理HE，弹力纤维染色获得病理诊断。二、原位杂交 无菌手术切除正常皮肤组织100mg，保存于液氮中待用。用TRIzol（GIBCO）试剂提取叫A法提取正常皮肤总 RNA。以 01 igo dT作引物，在逆转录酶作用下将总RNA逆转录生成正常皮肤cDNA。PCR反应合成h－C cDNA序列中位于5941—648foP的核昔酸片段。其上游引物5’－GCCAAGTTCACAACAGACCT－3’，下游引物 方l。CI。C庄疗刀后厂和q主住后厂一的矛达 叫I·5’－CCTGAGCCTTATCACCATTC－3’（引物由上海生工合成）。模板CDNA与载体连接合成重组质粒－CDNA。转化感受态细菌，扩增，纯化。质粒－CDNA线形化。应用地高辛体外转录法标记mRNA探针。所用启动子是沙门氏菌噬菌体Sp6和大肠杆菌噬菌体T7。有意义链转录的序列与靶mRNA是相同的，作为本实验的阴性对照；反意义链转录的序列与靶mRNA是互补的，用来探测靶mRNA。以标记的p－ActinRNA探针做原位杂交为阳性对照。应用地高辛标记的原位杂交技术检测基因的表达。显色剂应用四哇氮?