研究背景和目的胃癌(Gastric Cancer,GC)是当今世界常见的恶性肿瘤,严重危害人类的健康。目前手术切除仍是早期胃癌最有效的治疗方案,但胃癌早期往往无明显症状,多数患者就诊时病情已到进展期,失去手术根治的机会。化疗是进展期胃癌的主要治疗手段,但效果不明显。因此,迫切需要探索低毒有效的胃癌治疗策略。三氧化二砷(Arsenic trioxide,ATO)是传统中药砒霜的有效成分,在中国已有数千年的用药历史,目前是治疗急性早幼粒细胞白血病的常用药物。近年来,陆续有临床和基础研究证明三氧化二砷对实体瘤也有治疗作用。研究发现,三氧化二砷主要通过诱导细胞凋亡、抑制增殖、诱导分化、减少血管再生、抑制侵蚀转移等途径发挥抗肿瘤作用。而对于胃癌,三氧化二砷能抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡,但具体机制尚不明确。自噬是维持细胞内稳态的重要机制,在饥饿、缺氧或其他特定的应激条件下,细胞可通过自噬对缺陷蛋白和细胞器进行降解和循环利用。细胞凋亡是多细胞生物体内的一种程序性死亡过程,是多细胞生物保持健康和清除体内缺陷细胞的基础。自噬和凋亡在决定细胞命运中发挥着重要作用,而且它们两者之间存在着复杂的相互关系。而越来越多的研究发现,抑制自噬对人胃癌细胞具有促凋亡作用。本研究旨在探讨三氧化二砷、自噬与胃癌细胞凋亡之间的关系。研究内容和实验结果本研究以HGC-27及BGC-823胃癌细胞为实验材料,通过MTT实验、划痕实验、Transwell实验、Annexin V/PI凋亡检测方法、透视电子显微镜、激光共聚焦显微镜及蛋白免疫印迹等技术和手段,探讨三氧化二砷对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为的影响,同时明确三氧化二砷对胃癌细胞自噬及凋亡的诱导作用。随后,通过联合使用自噬抑制剂氯喹,探讨抑制自噬后三氧化二砷对胃癌影响的变化,并且进一步分析自噬与凋亡在胃癌中的关系及相互作用。研究结果如下:1.三氧化二砷(1、2、4、8、16、32 μM)作用于 HGC-27 及 BGC-823 胃癌48小时后,细胞活力呈浓度依赖性下降,而联用自噬抑制剂氯喹(6.25 μg/ml)后,能进一步增强三氧化二砷对胃癌细胞的抑制作用。2.三氧化二砷(4 μM)与氯喹(6.25 μg/ml)单独或联合作用于HGC-27及BGC-823胃癌细胞24小时后,划痕实验结果显示三氧化二砷联用氯喹后能显著降低划痕愈合率,提示两药联合使用可降低胃癌细胞的迁移能力。3.三氧化二砷(4 μM)与氯喹(6.25 μg/ml)单独或联合作用于HGC-27胃癌细胞24小时后,Transwell实验结果显示三氧化二砷与氯喹单独用药均能减弱胃癌细胞的侵袭迁移能力,而两药联合使用,能进一步减弱胃癌细胞的侵袭迁移能力。4.三氧化二砷(1、2、4、8、16μ M)作用于HGC-27胃癌细胞48小时后,通过Annexin V/PI凋亡检测法检测细胞凋亡率,胃癌细胞的凋亡率呈浓度依赖性升高,而联用自噬抑制剂氯喹(6.25 μ g/ml)后,能进一步升高胃癌细胞的凋亡率。5.三氧化二砷(4 μ M)作用于HGC-27胃癌细胞48小时后,通过透视电子显微镜技术,能观察到胃癌细胞内出现自噬相关改变。6.三氧化二砷(4 μ M)作用于HGC-27胃癌细胞24小时后,通过特殊染料染色及激光共聚焦显微镜观察,胃癌细胞绿色荧光明显增强,初步证明三氧化二砷能诱导胃癌发生自噬;进一步在不同时间点(0h、12h、24h、48h及96h)对胃癌细胞进行观察,发现胃癌细胞内有自噬流的形成,进一步证明三氧化二砷能诱导胃癌发生自噬。7.三氧化二砷(2、4、8μM)作用于HGC-27胃癌细胞48小时后,通过蛋白免疫印迹技术检测自噬及凋亡相关蛋白,结果提示随着三氧化二砷药物浓度的升高,自噬相关蛋白中LC3B蛋白的表达量逐渐增加,而P62蛋白逐渐减少,同时LC3B-Ⅱ与LC3B-Ⅰ的比值逐渐升高;凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase3蛋白及Cleaved-PARP蛋白表达增加,PARP蛋白表达降低,而Bcl-2蛋白表达减少,Bax蛋白表达增加,Bcl-2与Bax蛋白的比值逐渐下降。这说明三氧化二砷能同时诱导胃癌细胞发生自噬与凋亡,并呈浓度依赖性。进一步联用自噬抑制剂氯喹后,LC3B-Ⅱ蛋白表达增加,P62表达增加,同时促凋亡Cleaved-Caspase3蛋白、Cleaved-PARP蛋白及Bax蛋白表达增加,而凋亡抑制蛋白PARP及Bcl-2蛋白表达减少,实验结果提示,抑制自噬可显著增强三氧化二砷诱导的细胞凋亡。实验结论综上所述,三氧化二砷在一定浓度范围内能抑制胃癌细胞增殖,此抑制作用具有浓度依赖性;三氧化二砷能诱导胃癌细胞发生凋亡及自噬,这种诱导作用也具有浓度依赖性;联用自噬抑制剂氯喹后,能进一步增强三氧化二砷对胃癌细胞的细胞毒作用;三氧化二砷诱导胃癌细胞自噬与凋亡过程中存在交互作用,抑制自噬可以增强细胞凋亡。