褪黑素（melatonin,MT）是一种神经内分泌激素,主要在松果体中合成。大量研究证实,补充褪黑素对冠心病具有预防作用。近年来发现,褪黑素具有抗动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）作用。褪黑素可抑制apoE-/-小鼠AS进展,其机制与抑制巨噬细胞线粒体活性氧（mt ROS）的水平和NLRP3的激活,缓解高脂血症大鼠内皮细胞功能紊乱和炎症因子的释放等生物学活性有关,尤其是对血管内皮细胞（vascular endothelial cells,VECs）具有保护作用。细胞焦亡（pyroptosis）是一种程序性细胞死亡方式,焦亡是新近发现的VECs损伤的重要形式,MT可拮抗VECs焦亡。前蛋白转化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9）与AS的发生发展关系密切,其主要通过脂质途径和非脂质途径参与AS进程,PCSK9对VECs具有损伤作用,PCSK9能否引起VECs焦亡性损伤?MT能否通过调控PCSK9的表达而拮抗PCSK9对VECs的损伤,以及以焦亡抑制的方式拮抗PCSK9对VECs的损伤?这些均不清楚,故本研究拟在人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）和apoE-/-小鼠AS动物模型上进行实验,先在HUVECs上分析氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,oxLDL）对HUVECs焦亡的影响及PCSK9是否参与该过程,并分析HUVECs经oxLDL和MT处理的包括circRNA、miRNA和基因在内的全转录组,较为系统地观察其差异表达谱,从中筛选和寻找,对应于PCSK9的circRNA和miRNA,建立circRNAmiRNA-PCSK9调控路线图,并进一步通过敲减/过表达的方式,验证该通路的存在,及其在oxLDL致VECs焦亡中的参与程度,MT是否通过该circRNA-miRNA-PCSK9途径拮抗oxLDL致VECs焦亡。以上述工作为基础,在apoE-/-小鼠AS动物模型上验证该通路的存在及其对AS的作用。第一章oxLDL通过上调PCSK9促进血管内皮细胞焦亡目的:在细胞水平观察oxLDL对细胞焦亡及焦亡相关分子表达的影响,及对PCSK9表达的影响,从线粒体基因UQCRC1的表达及线粒体功能入手,分析其作用机制。方法:培养HUVECs,小干扰RNA与慢病毒转染敲减或过表达PCSK9与UQCRC1表达,荧光实时定量PCR检测mRNA表达水平,western blot检测蛋白水平,Mito SOX Red探针检测mt ROS,JC-1法测线粒体膜电位,磷钼酸比色法检测线粒体ATP含量,采用免疫荧光法检测PCSK9蛋白水平,碘化丙啶（PI）与Hoechst33342检测细胞染色体断裂情况。培养HUVECs,用oxLDL（50和100μg/ml）与HUVECs共同孵育24h,western blot检测焦亡相关分子NLRP3、caspase-1和IL-18的表达,qRT-PCR和ELISA检测IL-1β的表达和释放,PI/Hoechst33342双染检测细胞染色体断裂,酶法测LDH水平分析细胞损伤,western blot,qRT-PCR检测PCSK9蛋白和mRNA的表达;用小干扰RNA技术敲减HUVECs中PCSK9表达,转染构建的PCSK9过表达慢病毒载体,使PCSK9高表达,qRT-PCR和western blot检测PCSK9的mRNA和蛋白水平,分析PCSK9过表达效率,western blot检测焦亡相关蛋白及UQCRC1表达,ELISA检测细胞上清中的IL-1β表达,qRT-PCR检测细胞IL-1βmRNA表达水平,酶法测定上清液LDH水平,PI/Hoechst33342双染检测细胞染色体断裂情况,磷钼酸比色法检测线粒体ATP含量,Mito SOX Red探针检测mt ROS,JC-染色后,分别用荧光显微镜和流式细胞术检测线粒体膜电位水平;为进一步分析PCSK9是否通过下调UQCRC1致线粒体功能障碍,进一步构建UQCRC1小干扰RNA敲减UQCRC1的表达,实验分为对照组、oxLDL组、小干扰RNA对照组、oxLDL+si PCSK9、oxLDL+si PCSK9+si UQCRC1组,共5组,qRT-PCR和western blot检测UQCRC1的mRNA和蛋白水平,分析敲减效率,检测mt ROS、ATP、线粒体膜电位分析线粒体功能变化。结果:oxLDL可上调NLRP3、caspase-1和IL-18的表达水平,qRT-PCR和ELISA结果表明,oxLDL可促进IL-1β的表达和释放,oxLDL处理后HUVECs损伤水平增加,且呈现浓度依赖性,且在浓度达到100μg/ml的浓度和24h处理细胞的时间效果最佳;不同浓度oxLDL（50和100μg/ml）处理HUVECs后,PCSK9表达增加,细胞免疫荧光结果与此相一致,即不同浓度oxLDL处理HUVECs后荧光强度增加,oxLDL可上调HUVECs中PCSK9的表达水平,且呈现浓度依赖性。转染PCSK9 si RNA,敲减HUVECs内PCSK9的表达,干扰阳性组PCSK9表达明显下降,表明干扰成功;western blot结果表明,相对于oxLDL组,oxLDL+si PCSK9组NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的表达水平明显降低,且IL-1β的表达和释放水平同样降低,LDH活性检测下降,PI/Hoechst33342双染结果表明,干扰PCSK9后细胞死亡率降低,结果表明,敲减PCSK9的表达可抑制oxLDL诱导HUVECs的焦亡。转染构建的PCSK9过表达慢病毒载体,qRT-PCR和western blot结果表明,PCSK9过表达慢病毒转染HUVECs成功,过表达PCSK9后NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的表达水平明显增加,且IL-1β的表达和释放水平增加;过表达PCSK9后,LDH活性增加,PI/Hoechst 33342双染结果说明细胞死亡率明显升高,以上结果说明,上调PCSK9的表达可促进HUVECs焦亡;过表达PCSK9可促进ROS水平的增加及ATP生成减少,说明上调PCSK9可能导致线粒体功能紊乱,进而促进ROS的水平增加;过表达PCSK9后发现UQCRC1表达下调,以上结果说明,PCSK9可能通过抑制UQCRC1的表达,介导线粒体功能紊乱,促进mt ROS的增加,进而导致焦亡的发生。为进一步验证PCSK9是否通过UQCRC1促进线粒体功能紊乱,转染PCSK9 si RNA后检测UQCRC1的表达能否恢复,western blot结果表明,相对于oxLDL处理组,干扰PCSK9后UQCRC1的表达增加。同时转染PCSK9 si RNA和UQCRC1 si RNA,经验证UQCRC1si RNA转染成功,对同时转染PCSK9 si RNA和UQCRC1 si RNA的细胞与oxLDL孵育后,检测mt ROS水平,结果表明,相比于oxLDL+si PCSK9组,同时干扰PCSK9和UQCRC1细胞ROS水平增加,且线粒体膜电位紊乱程度增加,以上结果说明,PCSK9可能通过调控UQCRC1促进线粒体功能紊乱和mt ROS生成增加,进而促进焦亡的发生。小结:oxLDL上调PCSK9表达,促进HUVECs焦亡;PCSK9通过UQCRC1/ROS途径介导oxLDL诱导HUVECs焦亡。第二章褪黑素通过circ＿0000033/miR-214-3p/PCSK9途径调控血管内皮细胞焦亡目的:前期研究发现MT具有拮抗oxLDL诱导血管内皮细胞焦亡抗AS作用,但其作用机制的研究缺乏系统性,因此本部分拟通过分析oxLDL和MT处理HUVECs后的全转录组,筛选差异表达circRNA、miRNA和差异表达基因,系统地探索oxLDL上调PCSK9促HUVECs焦亡的分子机制。以PCSK9为靶基因,从差异miRNA中得到以PCSK9为靶基因的miRNA,再追溯与miRNA靶向结合的circRNA,寻找MT抗血管内皮细胞焦亡的circRNA-miRNA-PCSK9途径,并结合线粒体功能变化,较为系统地探索其作用机制。方法:培养HUVECs,进行全转录组分析。分为3组:对照组、oxLDL处理组、oxLDL+MT预处理组,将细胞处理24h后,提取RNA。随后,经过质检和上机预处理,使用华大集团DNBseq平台进行全转录组基因测序,采用Pearson相关系数分析样本间相关性,华大基因Dr.TOM系统进行差异基因及富集分析,KEGG通路分析所有差异基因参与的细胞生物学过程,筛选差异表达circRNA、miRNA和差异表达基因。基于NCBI查找human circ＿0000033的mRNA序列（flank-hsa＿circ＿0000033）,通过Primer Premier 5.0设计引物,将限制性内切酶Hind III、Bam HI的酶切位点加入5’端。从293T细胞中提取RNA后逆转录为c DNA,PCR扩增及电泳,以此取得目的片段（鉴定序列如下）。酶切pc DNA3.1载体后回收目的片段后。连接载体和目的基因片段后,筛选提取阳性质粒并测序验证,转染293T细胞后,分析感染复数（MOI）,qRT-PCR检测转染效果。选择JASPAR软件预测circ＿0000033与miR-214-3p靶向结合作用,选择物种和基因名称,输入预测基因种类筛选结合的转录因子以及相对应的结合位点。利用该数据库分析circ＿0000033与miR-214-3p靶向结合情况及其结合位点情况。miR-214-3p与PCSK9的结合采用Target Scan（http://www.targetscan.org/mamm＿31/）预测靶向基因结合,查看结合优势打分及结合位点。qRT-PCR和western blot检测PCSK9的mRNA和蛋白水平,酶法测定上清液LDH水平,PI/Hoechst33342双染检测细胞染色体断裂情况,磷钼酸比色法检测线粒体ATP含量,Mito SOX Red探针检测mt ROS,JC-染色后,分别用荧光显微镜和流式细胞术检测线粒体膜电位水平,双荧光素酶基因报告系统分析miR-214-3p与PCSK9的靶向结合,荧光原位杂交检测circ＿0000033和miR-214-3p定位及结合情况。结果:全转录组平台测序共鉴定到1920个小RNA,相关性皆高于95.6%可继续用于后续分析。oxLDL组相比于对照组有14356个基因下调,14782个基因上调（包括PCSK9）;oxLDL+MT组相比于oxLDL组有267个基因下调,479个基因上调。KEGG通路分析所有差异基因参与的细胞生物学过程,有传递与代谢、信号转导、转录调控等。以上结果说明oxLDL和MT处理后,细胞内相关基因发生显著变化以应对外界刺激。oxLDL处理显著上调了NLRP3、Caspase1和IL-1β的表达,但MT处理后这些分子表达下降。与oxLDL组相比,MT减少IL-1β在mRNA水平的表达。20μM的MT预处理HUVECs 2h后,oxLDL诱导的PCSK9表达被显著抑制。这些结果表明,MT可显著缓解oxLDL引起的血管内皮细胞焦亡。为从circRNA入手,探究MT调控的ce RNA机制。首先,将差异基因表达量取均值后,取oxLDL组/control组表达量的对数,再取oxLDL+MT组/oxLDL组表达量的对数进行分析,分析后共有26个circRNA被oxLDL上调后,可被MT处理下调。其中circ＿0000033取对数值后的差异最大。构建LV-circ＿0000033慢病毒载体,结果发现随着病毒载体浓度的降低,细胞中荧光强度降低,表明转染效率有显著的浓度依赖性。相比于空白对照组,单独过表达circ＿0000033后TUNEL阳性细胞增加,而MT处理组阳性细胞减少,单独过表达circ＿0000033后焦亡相关分子（NLRP3、Pro-caspase1、Caspase1、GSDMD、IL-18和IL-1β）表达显著上调,表明过表达circ＿0000033可激活NLRP3引起的焦亡通路;而MT处理组这些焦亡相关分子表达减少,表明MT可抑制焦亡通路。为进一步检测焦亡细胞,检测LDH和PI/Hoechst33342双染分别衡量死亡细胞和DNA断裂情况。circ＿0000033表达增加后,HUVECs内LDH活性增加,表明死亡细胞水平增加。PI/Hoechst33342双染结果发现,与空白对照组相比,转染LV-circ＿0000033组PI阳性细胞增加,MT处理组PI阳性细胞减少。这些结果说明,circ＿0000033的表达增加可引起细胞焦亡及焦亡通路的激活,而MT可抑制此过程。JC-1染色流式细胞术结果表明,相比于对照组,过表达circ＿0000033后可引起线粒体膜电位紊乱、mt ROS水平增加、细胞内ATP含量减少,而MT处理可抑制这一趋势。以上结果说明,MT可抑制circ＿0000033表达增加引起的线粒体功能紊乱。生物信息学分析circ＿0000033可能结合的靶向miRNA。转染circ＿0000033野生型（wildtype,WT）后,给予miR-214-3p mimic或miR-214-3p inhibitor,结果发现转染miR-214-3p inhibitor组荧光强度显著高于miR-214-3p mimic组,表明circ＿0000033与miR-214-3p有较强的结合。荧光探针后进行原位杂交结果发现,circ＿0000033与miR-214-3p都分布于胞质内且荧光叠加。这些结果说明circ＿0000033能够靶向结合miR-214-3p。miR-214-3p inhibitor转染后,TUNEL染色阳性细胞增加;而相对于miR-214-3p inhibitor组,MT处理后TUNEL染色阳性细胞、焦亡相关分子减少,miR-214-3p inhibitor组焦亡分子表达水平增加;而相比于miR-214-3p inhibitor组而言,miR-214-3p inhibitor+MT组焦亡分子显著降低。MT同样减少IL-1β的胞内表达及向胞外释放。随后检测LDH水平及PI/Hoechst33342阳性细胞,发现抑制miR-214-3p可增加胞内LDH水平及PI阳性细胞,而MT处理可抑制这一现象。这表明,MT可抑制miR-214-3p表达降低引起的HUVECs焦亡。为探究MT是否通过miR-214-3p途径调控线粒体功能,转染miR-214-3p inhibitor,结果发现,相比较于对照组,转染miR-214-3p inhibitor后线粒体膜电位发生紊乱、ATP生成减少、mt ROS释放增加,均可被MT缓解。以上结果表明,抑制miR-214-3p表达可引起线粒体功能紊乱及ROS的生成,而MT可抑制这一过程。生物信息学分析miR-214-3p与PCSK9有靶向结合位点,双荧光素酶报告系统分析,采用荧光探针标记miR-214-3p,免疫荧光检测PCSK9。结果发现,miR-214-3p与PCSK9主要分布于细胞质中,少量分布于胞核中,且在HUVECs内有大量结合。这也说明了,MT可通过miR-214-3p靶向结合PCSK9抑制其表达。小结:MT抑制oxLDL诱发HUVECs焦亡与焦亡相关分子表达;MT通过circ＿0000033/miR-214-3p/PCSK9途径抑制oxLDL诱发的HUVECs焦亡。第三章褪黑素对circ＿0000033/miR-214-3p/PCSK9途径及apoE-/-小鼠AS进展的影响目的:在apoE-/-小鼠AS动物模型上进行实验,验证circ＿0000033/miR-124-3p/PCSK9途径的存在及MT对该途径的影响,发现MT抗AS作用的新机制。方法:40只雄性apoE-/-小鼠高脂饮食喂养8周后随机分为2组:1、对照组（n=20）:高脂饮食,腹腔内注射200μl生理盐水,每周两次;2、MT干预组（n=20）:高脂饮食,行褪黑素灌胃,每次10mg/kg/d,连续处理8周后,腹腔继续注射褪黑素10mg/kg,一周2次。在16周完成各项检测后处死。眼球取血用于检测血脂及相关炎症指标。分离血管及周围组织,暴露主动脉弓及主要分支,体视显微镜拍摄并记录。取下心脏,行主动脉窦部连续切片,厚度7μm,冰冻切片后行HE、油红O以及Masson染色测主动脉AS斑块面积,取全长主动脉,用于mRNA与蛋白的检测。酶氧化法检测血浆TG、TC、LDL-C、HDL-C含量。qRT-PCR检测主动脉miR-214-3p、circ＿0000033、焦亡相关分子（NLRP3、caspase1、IL-18、GSDMD）、UQCRC1的mRNA表达,Western Blot检测主动脉蛋白焦亡相关分子（NLRP3、caspase1、IL-18、GSDMD）、PCSK9、UQCRC1蛋白表达水平。免疫荧光检测小鼠血管焦亡及通路相关蛋白（caspase1、GSDMD）、内皮细胞CD31标记、PCSK9、UQCRC1的蛋白表达水平,ELISA检测小鼠血清IL-1β和IL-18含量。结果:分离小鼠血管周围组织,暴露主动脉,通过体视显微镜观察小鼠血管斑块情况。结果发现,对照组中血管内壁富集大量白色斑块,对主动脉窦部进行连续切片,进行HE、Masson和油红O染色,褪黑素处理组中斑块面积显著减少。这一结果证实了MT缓解AS进展。与对照组相比较,MT处理组TG、TC、LDL-C水平显著降低,但两组之间的HDL-C无显著性差异。以上结果表明,褪黑素可以通过降低血脂水平,抑制AS病变。与对照组比较,MT处理组焦亡相关分子（NLRP3、caspase1、IL-18、GSDMD）在蛋白和mRNA水平表达减少。ELISA检测血清中IL-1β和IL-18水平,也发现MT处理组表达水平均显著低于对照组。血管组织中PCSK9和UQCRC1测定结果发现MT处理组PCSK9表达水平显著低于对照组,而UQCRC1表达水平增加。免疫荧光检测小鼠血管焦亡及通路相关蛋白表达水平的结果表明,MT处理组血管内皮细胞焦亡相关蛋白（caspase1、GSDMD）表达均明显降低,PCSK9蛋白表达下降、UQCRC1蛋白表达明显升高。以上结果在动物整体水平验证了MT可抑制血管内皮细胞焦亡的发生,且与PCSK9、UQCRC1表达水平相关。利用qRT-PCR检测两组小鼠主动脉组织中circ＿0000033和miR-214-3p表达的影响。结果发现,MT组circ＿0000033水平相比于对照组显著下降,而miR-214-3p水平显著增加。这说明,在动物整体水平MT也可以通过抑制circ＿0000033表达,减少其与miR-214-3p的结合,进而增加miR-214-3p与靶基因的结合,进而缓解焦亡,最终抑制apoE-/-小鼠AS的进展。小结:MT减少apoE-/-小鼠主动脉AS病变,降低TG、TC、LDL-C水平;MT减少apoE-/-小鼠主动脉焦亡相关分子及PCSK9的表达,促进UQCRC1的表达;MT下调apoE-/-小鼠主动脉circ＿0000033,上调miR-214-3p表达。结论1、oxLDL通过上调PCSK9的表达,进而激活UQCRC1/ROS途径,导致HUVECs焦亡;2、MT通过circ＿0000033/miR-214-3p/PCSK9途径,抑制oxLDL诱导的焦亡相关分子表达,进而抑制HUVECs焦亡;3、MT下调高脂饮食喂养apoE-/-小鼠主动脉circ＿0000033,上调miR-214-3p表达,进而抑制PCSK9表达和焦亡相关分子的表达,减少血管内皮细胞焦亡,抑制apoE-/-小鼠主动脉AS病变形成。