细胞自噬是一种细胞内的降解通路,细胞自噬将细胞内受损、变形、衰老或失去功能的蛋白质以及细胞器运送至溶酶体,并进行消化和降解。在整个生物进化的过程中,细胞自噬是一种十分保守的过程,从酵母到植物细胞再到哺乳动物细胞,都存在这样的过程,并且其中的很多调节因子在多个生物物种中都能找到其同源蛋白。自噬(autophagy)是继凋亡(apoptosis)后,当前生命科学最热的研究领域之一。2016年诺贝尔生理学或医学奖授予了日本科学家Yoshinori Ohsumi,他对细胞自噬的机制研究做出了突出贡献。目前,靶向细胞自噬相关蛋白的药物开发已成为工业界、学术界的热点。在本论文中,我们选择了细胞自噬标志物蛋白LC3B及自噬半胱氨酸蛋白酶ATG4B作为小分子药物的筛选靶点,分别建立了首个高通量筛选平台,结合基于分子对接的虚拟筛选,开展LC3B以及ATG4B小分子抑制剂的发现、确证和机制研究的工作。针对细胞自噬标志物蛋白LC3B与LC3相互作用基序(LIR)的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)界面,首次建立了基于荧光偏振的高通量筛选平台,并综合基于分子对接的虚拟筛选药物设计手段,发现了首个靶向LC3B的小分子抑制剂,并通过多种生物物理及生物化学的方法,我们确定了该小分子为共价抑制剂,并成功解析了高分辨率的LC3B与小分子的复合物晶体结构。通过基于结构的药物设计,我们合成得到一系列化合物后,其中活性最强的化合物相对初始筛选得到的化合物,其活性提高约30倍,K_i值为两位数nM。分子和细胞水平(蛋白质谱、蛋白点突变以及结构相近的阴性化合物对照)实验表明,该候选化合物特异性地修饰LC3B的第49位赖氨酸,并占据LC3B的L-site进而阻断ATG4B以及ATG7与LC3B的相互作用,分别抑制了新生成的pro-LC3B向LC3B-I型的转化以及LC3B-I型向LC3B-II型的转化,抑制了细胞自噬体的形成,明显阻断了Torin-1及饥饿处理诱导的细胞自噬的发生。该项研究为基于LC3B的小分子发现提供了首个操作简单、稳定可重复、成本低廉的高通量筛选方法,为LC3B的功能研究提供了首个化学小分子探针,为靶向细胞自噬核心蛋白的药物开发提供了新颖的母核,有望加速推进LC3B以及细胞自噬功能的研究及小分子靶向药物的开发。针对自噬半胱氨酸蛋白酶ATG4B,建立了基于时间分辨荧光的高通量筛选平台,发现了靶向ATG4B的两个小分子抑制剂,通过多种生物物理及生物化学的方法,我们确定了其中一个化合物为选择性靶向ATG4B半胱氨酸的共价小分子抑制剂。ATG4B与该小分子结合后构象发生变化、不能结合及酶切pro-LC3B;另一个化合物为可逆小分子抑制剂,该化合物及其衍生物均能在细胞内抑制ATG4B对pro-LC3B的剪切,相同浓度下抑制效果不劣于我们发现的首个靶向于LC3B的小分子抑制剂。在该项研究中,我们首次发现了靶向ATG4B的共价变构的选择性小分子抑制剂,该小分子将用于ATG4B识别pro-LC3B动态过程的进一步研究。我们发现的另一个化合物,相对目前已发现的ATG4B小分子抑制剂,能观察到真实的细胞水平活性,将作为ATG4B小分子抑制剂细胞水平功能研究的阳性化合物进行进一步开发。