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伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)是引起猪伪狂犬病的病源,容易发生变异,疫苗防御效果不佳,一旦感染难以根治,死亡率高。母猪感染PRV会导致繁殖障碍,仔猪则表现为呕吐、拉稀、昏睡,其他动物感染则有奇痒、发热等病征,一旦爆发会导致严重的经济损失。本课题研究了应用腺相关病毒载体运载CRISPR/Cas9系统,对PRV的TK基因(编码胸苷激酶)、gE基因(编码糖蛋白)和VP16基因(编码泛素特异性蛋白酶)进行剪切,减弱PRV毒力和复制能力,初步探究PRV感染的抗病毒治疗的可行性。为PRV病毒的治疗提供了新的思路。基本方法:(1)应用pX601质粒构建编辑PRV的CRISPR/Cas9重组载体,pXTK、pXgE、pXVP16;这些载体分别带有靶向PRV的TK、gE、VP16基因的sgRNA(small guide RNA),同时也带有Cas9的表达系统,用于PRV基因编辑,通过PRV基因组测序验证该重组载体功能;(2)应用三质粒共转染法包装腺相关病毒载体(AAV),这三种质粒为:pXTK(或 pXgE 或 pXVP16)、pHelper、pAAV2/5,应用 Real-time PCR方法验证AAV的基因编辑功能,并计算AAV拷贝数;(3)用包装好的AAV病毒颗粒在细胞水平和小鼠上检验其抵抗PRV感染的能力。在细胞水平主要应用Real-time PCR检测PRV病毒量和相关细胞凋亡和免疫相关因子的表达情况,小鼠实验记录了小鼠的体征、死亡时间和死亡数量,对比抗病毒治疗前后小鼠的脾组织的病变情况,通过Real-time PCR检测小鼠脾组织中PRV病毒量和相关细胞凋亡和免疫因子的表达情况。实验结果:(1)成功构建带有CRISPR/Cas9表达系统及相应sgRNA的pX601重组质粒:pXTK、pXgE、pXVP16;(2)成功包装具有基因编辑功能的AAV病毒,并达到实验需要滴度;(3)细胞水平和小鼠抗病毒治疗后PRV病毒量都有不同程度的降低,抗病毒治疗组小鼠的存活时间和一定时间内的存活率都有明显提高,说明具有基因编辑功能的AAV有明显的抗病毒治疗效果,细胞凋亡和免疫相关因子有变化,但没有明显的变化趋势。