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本文研究了发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)ATCC15834对南美蟛蜞菊(Wedeliatrilobata(L.)A.S.Hitche)嫩叶外植体的遗传转化和培养基中碳源、氮源、P、Ca2+浓度等的消耗变化及其对毛状根生长的影响,以及毛状根提取液对青箱(CelosiaargenteaL.)、三叶鬼针草(BidenspilosaL.)、马唐(Commoncrabgrassherb)、稗草(Echinochloacrusgalli(L.)Beauv.)、狗尾草(Greenbristlegrass)、蒲公英(Herbataraxaci)、水稻(OryzasativaL.)和菜心(BrassicaparachinensisBailey)等种子萌发的影响。所得结果如下:
发根农杆菌(A.rhizogenes)ATCC15834感染南美蟛蜞菊(W.trilobata(L.)A.S.Hitche)幼嫩叶片外植体7d后,从其叶片切口中脉处或附近产生毛状根。所产生的毛状根能在无外源激素的Ms培养基上快速自主生长。PCR扩增结果证实,发根农杆菌Ri质粒的,ro1b和ro1c基因已在南美蟛蜞菊毛状根基因组中整合并得到表达。
南美蟛蜞菊毛状根在MS液体培养基中的生长曲线基本呈”S”型。在0~7d内处于生长迟滞期、7~28d为快速生长期、28d后进入生长减慢期,35d后,毛状根生物量增长呈下降的趋势。在其培养过程中培养基的蔗糖被快速消耗,培养至7d时蔗糖被消耗近50%,至35d时,培养基中的残存蔗糖浓度约为起始浓度的3.39%;而硝态氮和无机磷也被迅速消耗;培养至7d时,培养基的硝态氮含量只剩下起始硝态氮含量的5.8%;而培养基无机磷含量则只有起始浓度的1.76%;相反地,毛状根对钙的吸收和利用要比硝态氮和无机磷慢得多,培养至35d时,培养基中仍残存约占起始浓度61.3%的Ca2+。当毛状根在分别添加葡萄糖、蔗糖或麦芽糖作为碳源的培养基中培养时,当含糖量小于5%时,以葡萄糖促进南美蟛蜞菊毛状根生长的效果最好,蔗糖次之;而当培养基含糖量大于5%时,以葡萄糖和蔗糖为碳源则抑制毛状根生长,而以麦芽糖为碳源仍能促进毛状根生长,但当培养基中麦芽糖浓度大于7%时,毛状根的生长也逐渐受到抑制。硝态氮和铵态氮是南美蟛蜞菊毛状根生长最好的氮源,且以NO3-(263.1μg/mL)与NH4+(577.2μg/mL)的配比对毛状根生长的效果最好。而当培养基的无机磷含量为2-3倍MS培养基的用量时,对南美蟛蜞菊毛状根生长的效果最佳,但培养基磷缺乏或浓度过高都不利于该毛状根的生长。当毛状根在不含Ca2+的培养基中培养时,毛状根变得纤细,分枝多,生长旺盛;而随着培养基中Ca2+浓度的增加,南美蟛蜞菊毛状根的生长则受到抑制。培养基的起始pH值在6-7之间较适合毛状根的生长,过酸、过碱都不利于毛状根的生长。光照条件下培养的毛状根呈墨绿色,根较粗壮;而暗培养的毛状根颜色浅白,根较纤细。
与对照相比,南美蟛蜞菊毛状根与非转化根(自然根)的提取液对青葙等种子的萌发都有抑制作用,但与非转化根相比,毛状根的乙醇提取液对水稻、三叶鬼针草、马唐、稗草、狗尾草和蒲公英种子萌发的抑制作用分别提高了48.3%、46%、19.9%、7.3、11.6%和1.1%;而且暗培养的毛状根乙醇提取液对青葙、水稻、三叶鬼针草、马唐、稗草、狗尾草和蒲公英种子萌发的抑制作用要比光照培养的毛状根乙醇提取液的抑制作用分别提高12.6%、24.7%、3.9%、17.7%、10.5%、13.8%和12.2%。与毛状根水提取液相比,毛状根醇提取液对菜心、水稻、马唐和鬼针草种子的萌发率抑制作用分别提高了67%、84%、2%和93%。该结果为今后获得矮化的毛状根植株以及设计合适的培养基来大规模培养南美蟛蜞菊毛状根奠定了实验和技术基础。