研究背景当前流行病学研究报道,由各种病因所致的慢性肾脏疾病（chronic kidney disease,CKD）患者约26至30万人,其中11%的CKD患者最终发展为终末期肾疾病,严重影响人们的生活质量。现阶段,预防和缓解CKD疾病进展的治疗方法主要包括药物治疗、营养治疗和人工肾脏替代治疗以缓解体内毒素蓄积和代谢紊乱而出现的各种症状。尽管有这些疗法,然而其疗效有限,亟待解决。据当前文献报道,肾小管间质纤维化是CKD的主要病因之一,其主要由于长期慢性炎症反应,刺激肾小管间质细胞释放大量促纤维化相关细胞因子,从而产生细胞外基质大量沉积所致。细胞核因子（NF-κB）信号通路在调控机体炎症反应中发挥重要作用。此外,已有大量文献报道转化生长因子TGF-β/Smad信号通路是调控肾间质细胞纤维化的重要信号通路之一。Mindin基因属于细胞外基质蛋白家族一员,该基因能够募集体内大量免疫反应细胞,激活体内免疫炎症反应,在维持体内疾病代谢的稳定发挥重要作用。当前,已有相关文献报道Mindin基因在肿瘤、心血管、糖尿病肾病以及肝脏纤维化中发挥重要作用,但是,其在肾间质纤维化的疾病进展过程中具体机制尚未阐明。因此,结合目前文献报道和我们前期研究结果,我们假设Mindin基因可能通过调控NF-κB信号通路和TGF-β/Smad信号通路,从而诱导肾小管上皮细胞长期发生炎症反应,进一步促进细胞外基质蛋白沉积,导致肾小管间质细胞发生纤维化。本课题旨在探索Mindin基因在肾纤维化发生发展中的作用基质,以期为临床治疗肾纤维化患者提供新的理论依据。方法第一部分:我们利用C57BL/6野生型小鼠建立肾缺血再灌注诱导的肾脏纤维化模型,利用HE染色和Masson染色确定模型构建情况,通过实时荧光定量PCR（RT-q PCR）、免疫荧光和免疫组化技术检测假手术组以及模型组小鼠肾组织Mindin的表达和分布。细胞水平,我们通过不同时间段使用TGF-β试剂刺激肾小管上皮细胞构建肾纤维化模型,探索Mindin基因与肾纤维化的关系。第二部分:利用肾小管上皮细胞构建过表达Mindin基因的稳转细胞系,探索Mindin基因在细胞水平对肾间质纤维化过程中细胞外基质蛋白的影响。随后,利用C57BL/6野生型小鼠和Mindin基因敲除小鼠构建肾纤维化模型,通过HE染色和免疫印迹技术检测Mindin对小鼠肾组织结构的影响以及表达情况,并且使用Masson染色、苏伊士红染色、免疫组化、免疫荧光和免疫印迹技术,检测Mindin基因在动物水平对小鼠间质纤维化过程中细胞外基质蛋白即纤粘蛋白、钙粘蛋白和1型胶原蛋白的影响。第三部分:在细胞水平构建肾纤维化模型,利用免疫荧光技术检测NF-κB信号通路核心亚基p65表达情况,通过免疫印迹技术检测NF-κB信号通路相关蛋白磷酸化p65（P-p65）、p65、P-IκBα和IκBα的表达情况,随后利用免疫印迹分析空白对照组,转染对照组和转染组HK2细胞给予和未给予TGF-β药物刺激时,TGF-β/Smad信号通路相关蛋白TGF-β、P-smad2、Smad2、P-smad3、Smad3和Smad7的表达情况。动物水平,利用C57BL/6野生型小鼠和Mindin基因敲除小鼠构建肾纤维化模型,利用免疫组化技术检测p65在小鼠肾组织中的表达情况,通过免疫印迹技术检测NF-κB信号通路相关蛋白表达情况,利用RT-q PCR检分析假手术组野生型小鼠、假手术组Mindin基因敲除组小鼠,模型组野生型小鼠和模型组Mindin基因敲除组小鼠IL-1β、IL-6和TNF-α转录水平表达情况,接着,利用免疫组化和免疫印迹技术检测TGF-β/Smad信号通路相关蛋白在不同分组中小鼠肾组织的表达变化。结果第一部分:模型组小鼠肾组织与假手术组小鼠肾组织相比,其肾小管扩张明显,肾小管及肾小球有血细胞和炎症细胞浸润,模型组小鼠肾组织肾损伤评分较假手术组小鼠肾组织评分显著增加。Masson染色结果提示胶原蛋白主要集中在模型组小鼠肾组织的扩张肾小管周围,而假手术组小鼠肾组织几乎无胶原蛋白沉积。此外,模型组小鼠肾组织Mindin基因表达量比假手术组Mindin基因表达量显著增加,且Mindin基因主要表达于扩张肾小管细胞质,并且,RT-q PCR和免疫印迹检测检测结果与免疫荧光结果一致。细胞水平,Mindin表达量在给予20ng/ml TGF-β药物刺激后6小时、12小时和24小时表达量逐渐增加,且24小时表达量最高第二部分:我们利用慢病毒干预肾小管上皮细胞HK2,构建了Mindin基因稳定表达细胞株。荧光结果提示转染组（p LV-Mindin）组细胞较转染对照组（p LV-Vector）细胞相比,镜下荧光表达量显著增加免疫印迹技术结果提示转染组细胞较对照组相比,Mindin表达量显著增加,当给以TGF-β刺激后,Mindin表达量进一步增高,且p LV-Mindin组细胞Mindin表达量显著高于对照组Mindin表达量;并且,免疫印迹结果表明未给予TGF-β药物刺激时,p LV-Mindin的纤粘蛋白和I型胶原蛋白表达量高于p LV-Vector以及空白对照组（Control）,而p LV-Mindin的钙粘蛋白表达量低于p LV-Vector,予20 ng/ml 24小时TGF-β条件下刺激HK2细胞建立肾纤维化模型时,该趋势进一步增加。动物水平,HE染色结果提示模型组野生型小鼠肾组织与正常组野生型小鼠肾组织结构相比,肾小管扩张明显扩张,大量肾小管间出现血细胞,并且肾小管上皮细胞坏死和炎性细胞浸润明显,Mindin基因敲除小鼠较野生型小鼠相比,小管扩张程度、血细胞和炎性细胞浸润范围以及坏死程度有所缓解;苏伊士红和Masson染色结果提示模型组野生型小鼠肾组织扩张肾小管出现大量胶原纤维蛋白沉积,然而Mindin基因敲除后,小鼠肾小管内胶原蛋白沉积减少。而且,免疫印迹结果发现模型组野生型小鼠肾组织与正常组相比,1型胶原蛋白表达加深,主要集中肾小管间质,然而Mindin基因敲除后,1型胶原蛋白表达减弱,且表达范围有所缩小。免疫荧光结果提示模型组野生型小鼠肾组织的纤粘蛋白表达量较假手术组野生型小鼠增加,Mindin基因敲除后,纤粘蛋白表达减弱。免疫印迹结果提示肾纤维化促进1型胶原蛋白和纤粘蛋白表达,抑制钙粘蛋白表达,然而Mindin基因敲除后,1型胶原蛋白和纤粘蛋白表达量有所降低,钙粘蛋白表达增加。第三部分:细胞水平,免疫荧光结果提示未给予TGF-β药物刺激时,p LV-Mindin NF-κB信号通路核心蛋白p65细胞质的表达量高于p LV-Vector和Control组,给予TGF-β药物刺激建构肾纤维化模型p65蛋白从肾小管上皮细胞细胞质移位至细胞核,且p LV-Mindin p65的表达量高于对照组。肾小管细胞核蛋白免疫印迹结果提示未给予TGF-β药物刺激时,p LV-Mindin和对照组细胞几乎不表达p65,给予TGF-β药物刺激时,p65表达量增加,且p LV-Mindin p65的表达量高于对照组。并且,未给予TGF-β药物刺激时,p LV-Mindin磷酸化p65（P-p65）和P-IκBα的表达量高于对照组,而p LV-Mindin IκBα的表达量低于对照组,给予TGF-β药物刺激后,该趋势进一步扩大。TGF-β/Smad信号通路相关蛋白免疫印迹结果提示未给予TGF-β药物刺激时,p LV-Mindin TGF-β、P-smad2和P-smad3的表达量高于对照组,而p LV-Mindin Smad7的表达量低于对照组,给予TGF-β药物刺激后,该改变进一步增加。动物水平,免疫组化结果提示肾纤维化诱导小鼠肾组织细胞质p65表达显著上调,且p65表达于扩张肾小管上皮细胞大部分细胞核,然而Mindin基因敲除后,细胞质p65表达量有所下降,且细胞核p65表达数据有所减少;小鼠肾组织免疫印迹结果提示与假手术组野生型小鼠相比,肾纤维化模型组野生型小鼠肾组织总蛋白P-p65和P-IκBα的表达量高于对照组P-p65和P-IκBα的表达量,敲除组Mindin基因稳转细胞株IκBα的表达量低于对照组IκBα的表达量,然而模型组Mindin基因敲除小鼠与模型组野生型小鼠相比,细胞质P-p65和P-IκBα表达量有所下降,IκBα的表达量增加。RT-q PCR结果提示肾纤维化模型组野生型小鼠肾组织IL-1β、IL-6和TNF-α转录水平的表达量高于对照组IL-1β、IL-6和TNF-α的转录表达水平,然而敲除Mindin降低了这些转录因子的转录水平。此外,Smad2免疫组化的结果表明,与假手术组的野生型小鼠相比,肾纤维化模型组野生型小鼠肾组织细胞质和细胞核Smad2表达显著上调,且主要集中扩张肾小管上皮细胞细胞核,然而Mindin基因敲除后,小鼠肾组织细胞质Smad2表达量减少。随后,免疫印迹技术结果提示肾纤维化促进TGF-β/Smad信号通路相关蛋白如TGF-β、P-smad2和P-smad3表达,抑制Smad7蛋白表达,敲除Mindin基因后失活TGF-β/Smad信号通路。结论第一部分:在肾缺血再灌注诱导的肾间质纤维化动物模型及TGF-β药物诱导的肾小管细胞纤维化模型中,Mindin基因表达均显著上调,说明Mindin基因与肾间质纤维化存在的密切关系。第二部分:细胞和动物水平发现Mindin通过诱导促纤维化相关因子表达,促进细胞外基质蛋白沉积,加快肾间质纤维化的发生发展,阻碍Mindin基因能够保护小鼠肾组织结构和功能。表明在肾间质纤维化进程中,Mindin基因发挥重要作用。第三部分:Mindin基因可能通过活化NF-κB信号通路和TGF-β/Smad信号通路,从而诱导肾小管上皮细胞发生炎症反应,进而促进细胞外基质蛋白沉积,导致肾小管间质细胞发生纤维化;抑制Mindin基因失活NF-κB和TGF-β/Smad信号通路,减轻小鼠肾组织损伤。证实Mindin可能作为治疗肾纤维化患者的一个新靶点。