浒苔低聚糖结构鉴定及其降血糖机理的蛋白质组学研究

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绿藻浒苔(Enteromorpha prolifera)隶属于绿藻门石莼纲石莼目石莼科浒苔属。本文在解析鉴定浒苔低聚糖(EPO)的结构基础上,结合动物生理学和病理学实验结果,通过基于Tandem mass tag(TMT)的定量蛋白质组学技术,获得特异性差异靶蛋白并分析靶蛋白的生物学功能及其相关信号通路的调节机理,初步阐明绿藻浒苔低聚糖的降血糖机理,为绿藻浒苔调控机体糖代谢在营养功能食品的研发上提供了理论和试验依据。主要研究结果如下:(1)通过DEAE-52与Bio-Gel P-2柱层析分离,获得纯化的浒苔低聚糖组分EPO-1。采用傅立叶红外光谱(FT-IR)、高效液相色谱(HPLC)、多角度激光散射(MALLS)和核磁共振(NMR)光谱表征EPO-1的结构。PMP柱前衍生化高效液相色谱法分析表明,EPO-1的单糖组成由D-甘露糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖、D-葡萄糖和D-半乳糖组成,其摩尔比为0.61:12.53:30.59:3.26:1.73:21.69。EPO-1的平均摩尔质量为(Mw)为4.28×10~3 Da,平均分子量(Mn)为2.47×10~3Da。EPO-1主要包含六种类型的单糖残基:→2)-β-D-Glcp A-(1→、→3,6)-β-D-Manp-(1→、→4)-α-D-Glcp-(1→、→6)-β-D-Galp-(1→、β-L-Rhap-(1→、→4)-β-D-Galp A-(1→。(2)建立二型糖尿病(T2DM)大鼠模型,观察分析浒苔低聚糖150 mg/kg低剂量(EPOL)和300 mg/kg高剂量(EPOH)灌胃T2DM大鼠28天的干预治疗效果。试验周期开始阶段,与正常组相比,模型组的空腹血糖值(FBG)、糖化血红蛋白(HBAC)的含量水平显著升高和体重(BW)水平显著下降(P<0.05)。在糖尿病大鼠中分别使用盐酸二甲双胍、EPOL和EPOH干预治疗4周后,与模型组相比,糖尿病大鼠中FBG和OGTT的水平显著降低,表明EPO能够显著改善T2DM大鼠的葡萄糖代谢。特别是EPOL处理对糖尿病大鼠的OGTT水平具有更佳改善效果。苏木精–伊红染色的病理切片结果显示,EPO通过抵抗组织氧化损伤压力,减少由于糖尿病并发症所导致肝脏、胰腺和空肠的氧化损伤。采用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)技术测定EPO对PI3K和Akt转录水平的影响,相比于模型组,EPOL组显著上调大鼠空肠组织中的PI3K及Akt的m RNA表达。Western blot(WB)结果显示,EPOL组能够显著上调靶蛋白PI3K、Akt的蛋白表达。同时,对维持肠道内皮细胞稳态的相关基因MEK与ERK 1/2的分析,相比于模型组,EPOL组不仅能显著上调空肠组织中MEK的m RNA表达,而且显著上调靶蛋白MEK和ERK 1/2的表达水平。综合EPO干预体内降血糖活性以及对PI3K/Akt/MEK/ERK 1/2信号通路的影响,表明EPOL组呈现出较好的降血糖能力,且起到增强肠道屏障稳定和促进糖代谢作用。(3)采用TMT蛋白质组学方法对T2DM大鼠空肠组织的蛋白质进行定量,以探讨EPO干预机体后的关键蛋白与主要降血糖作用机理的研究。通过蛋白质组学总共检测到6810个蛋白质,定量信息5977个,按照蛋白质变化倍数比值为1.2,P值低于0.05为阈值,筛选差异蛋白质。结果显示:干预/模型组(EPOL/Model)中71个蛋白质表达上调,77个蛋白质表达下调;模型组/正常组(Model/Normal)中69个蛋白质表达上调,196个蛋白表达下调。相比于模型组,对EPOL处理后的差异表达靶蛋白进行生物信息学分析发现,基因本体论(GO)分析发现大多数差异靶蛋白的分子组成集中属于细胞外基质蛋白。差异蛋白质的KEGG富集分析主要涉及ECM-受体相互作用、蛋白质消化与吸收、花生四烯酸代谢、戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互转化、PPAR信号通路。差异蛋白质网络互作分析发现,EPOL/Model组与Model/Normal组中蛋白Col1a1、Ttr、Gc、C3位于互作网络中的功能网络交叉点,且对应的蛋白表达趋势互补。根据蛋白质相互作用的节点处,筛选出Ttr和Col1a1为潜在目标蛋白。对Normal组、Model组和EPOL组的指标进行斯皮尔曼相关性分析,分析葡萄糖代谢有关的生化指标与差异表达蛋白质之间的相关性,结果表明大鼠血清中的谷丙转氨酶(ALT)、总胆固醇(TC)、谷草转氨酶(AST)、低密度脂蛋白(LDL-C)、OGTT、HBAC、甘油三脂(TG)、FBG的水平与空肠表达蛋白基因Col1a1和Ttr之间呈负相关关系;HDL-C、PI3K、Akt、MEK、ERK 1/2与Col1a1和Ttr之间存在正相关关系。然后,在对Col1a1和Ttr进行RT-q PCR与WB验证,结果发现EPOL组大鼠空肠靶基因Col1a1的m RNA与蛋白表达水平与生物信息学分析结果一致。综上所述,Col1a1可作为干预治疗T2DM症状的潜在生物标记物。
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