论文部分内容阅读
真菌线粒体基因组大小变化极为剧烈，射脉侧菌（Phlebia radiata）线粒体基因组大小为156kb，而葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）仅为19kb。这一差异主要由线粒体保守基因中自剪接内含子数目的差异引起的。细胞色素b（cytochrome b，cob）是线粒体保守基因之一，编码呼吸链细胞色素还原酶复合体的一个亚基。LAGLIDADG归巢内切酶是一类DNA内切酶，通常寄存于自剪接内含子中，并通过归巢过程，驱动宿主内含子的扩增。LAGLIDADG归巢内切酶通常能够识别12到40bp长度的靶序列，具有极高的序列特异性，因此可以作为工具酶应用于靶向基因修饰和基因治疗。本研究以已公布的114种真菌线粒体基因组为依据，结合Pfam数据库公布的LAGLIDADG归巢内切酶序列，对cob内含子编码的Ⅰ型双结构域LAGLIDADG归巢内切酶和Ⅱ型LAGLIDADG归巢内切酶进行全面分析，以揭示其进化规律，并期望找到具有潜在功能的LAGLIDADG归巢内切酶，为靶向修饰工具酶的设计与开发提供新素材。本研究获得以下结果：真菌线粒体基因组中共编码224个Ⅰ型双结构域LAGLIDADG归巢内切酶和72个Ⅱ型LAGLIDADG归巢内切酶，它们主要分布在3个线粒体基因（cob、cox1和nad5）的内含子中。cob内含子分别编码24个Ⅰ型双结构域和27个Ⅱ型LAGLIDADG归巢内切酶。基因结构分析显示11个Ⅰ型双结构域归巢内切酶分布在临近内含子插入位点S506，S507，S508，S510，S511和S514（S506-S514）中，其余13个分布在7个距离较远的插入位点中；18个Ⅱ型归巢内切酶分布在S433插入位点中，其它9个零星散布在8个内含子插入位点中。聚类结果显示两种LAGLIDADG归巢内切酶可分别分为34和10个主要类群。cob中插入位点S506-S514的11个Ⅰ型以及插入位点S433的18个Ⅱ型LAGLIDADG归巢内切酶均位于相同的类群中，说明它们各自具有很近的亲缘关系。Ⅰ型和Ⅱ型LAGLIDADG归巢内切酶均存在跨生物界不同物种间的水平迁移和真菌线粒体不同基因间的水平迁移。系统发育分析表明cob插入位点S506-S514和S722的15个Ⅰ型双结构域LAGLIDADG归巢内切酶祖先序列在进化中经历过结构域的复制事件，其它位点的归巢内切酶推测是伴随结构域的复制，发生了单个结构域的丢失和重新插入；S433位点的18个Ⅱ型归巢内切酶与宿主内含子推测是从共同祖先垂直遗传而来，并在传递过程中伴有水平迁移，其它Ⅱ型归巢内切酶及宿主内含子则应是水平迁移的结果。对cob内存在的三组归巢内切酶分析表明，它们识别的靶序列存在明显差异；保守模体氨基酸分析显示它们大多数具有潜在内切酶活性，可作为潜在的模板应用于靶向基因修饰。本研究全面呈现了真菌线粒体cob内含子及其编码的Ⅰ型双结构域LAGLIDADG归巢内切酶和Ⅱ型LAGLIDADG归巢内切酶的存在状态和进化模式，为新型归巢内切酶的开发利用提供参考。