肿瘤的免疫疗法是继手术、放疗、化疗之后新兴的肿瘤治疗方案。相较于传统治疗直接靶向癌症细胞,免疫疗法的目标是正常免疫细胞,通过激活患者自身免疫系统功能来治疗癌症。但是肿瘤的免疫治疗效果却差强人意,原因在于肿瘤微环境存在着免疫逃逸现象。肿瘤的免疫逃逸是指肿瘤细胞通过自身的修饰和代谢改变及对其生活的微环境的影响从而逃避免疫系统的监督。肿瘤微环境中免疫细胞的功能状态改变是目前肿瘤免疫逃逸的研究热点。自然杀伤细胞是固有免疫系统的重要成员,是不同于T淋巴细胞和B淋巴细胞的一类大颗粒淋巴细胞,是参与机体抗病毒免疫及肿瘤免疫的重要的免疫细胞。依据CD56和CD16表达的丰度不同,人外周血NK细胞分为CD56^brightCD16^-和CD56^dimCD16⁺两大群。但是,在多种肿瘤组织中NK细胞表型受到影响,分泌细胞因子能力受到抑制,表现出低的杀伤活性,甚至丧失杀伤功能。GDF-15是我们实验室前期从人肝癌噬菌体文库中筛选得到的一个肿瘤来源的细胞因子。研究表明,GDF-15与多种肿瘤的发生发展密切相关,可作为肿瘤的分期分型指标。但是,目前对肿瘤微环境中的GDF-15的作用研究甚少,其与免疫细胞的相互作用的研究更是寥寥。本课题主要研究GDF-15对NK细胞的功能及对结肠癌免疫逃逸的调控作用,并初步探讨其机制,为肿瘤的免疫治疗提供思路。本课题设计了三个方面的内容:1.GDF-15对人外周血NK细胞的表型及功能影响的研究;2.GDF-15通过调控NK细胞功能对小鼠结肠癌生长的影响;3.GDF-15对NK细胞作用的机制研究。实验方法主要包括:1.GDF-15对人外周血NK细胞的表型及功能研究。用流式分选及美天旎免疫磁珠试剂盒分选健康人外周血NK细胞,分组刺激收集细胞后,采用Real-Time PCR、流式细胞术等方法检测NK细胞的表面受体NKG2D,NKp30,CD16a,CD56等的表达变化;流式细胞术,ELISA等方法检测IFN-γ、IL-10、IL-4、IL-6等细胞因子的表达及分泌变化;流式细胞术、CCK-8等方法检测GDF-15对NK细胞凋亡及增殖的影响;CFSE/PI双标及无标记细胞分析仪检测NK细胞对肿瘤细胞株的杀伤情况。2.体外杀伤实验筛选对NK细胞敏感的结肠癌细胞株与刺激后NK细胞混合接种进行NOD-SCID小鼠腹腔荷瘤后,分别在荷瘤的7天,14天和21天进行小动物成像实验验证GDF-15刺激对NK细胞功能的抑制。3.转录因子芯片筛选GDF-15刺激所调控的NK细胞功能相关转录因子;采用Real-Time PCR和Western Blot技术对转录因子的变化进行初步验证;siRNA干涉Id2后检测E2A和NKG2D的表达变化。通过以上的研究内容,得到以下研究成果:1.GDF-15刺激抑制了CD56^dimNK细胞表面活性受体NKG2D、NKp30的表达;抑制了CD56^dimNK细胞表面死亡受体的表达。抑制了CD56^dimNK细胞表型分子CD56的表达;GDF-15抑制了CD56brightNK细胞Th1型细胞因子IFN-γ、TNF-α的表达;促进了Th2型因子IL-10、IL-5、IL-13等的表达;抑制了NK细胞活化性分子CD69CD62L和c-kit的表达;体外GDF-15刺激不影响NK细胞的存活,但是可以抑制NK细胞增殖;同时抑制NK细胞对肿瘤细胞的杀伤。2.NK细胞可以有效杀伤结肠癌细胞SW480、SW620及HT29在体内,GDF-15刺激后的NK杀伤结肠癌的能力受到抑制。3.GDF-15刺激下调了NK细胞转录因子E2A的表达,促进了Id2的转录;干涉Id2后E2A和NKG2D的表达上升。本课题研究首次证实GDF-15可以抑制NK细胞的活化及杀伤功能,并在NOD-SCID小鼠体内得到验证,初步证实了GDF-15可以通过促进Id2的转录进而抑制E2A来影响NK细胞的功能。