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目的：
通过对健骨颗粒乙酸乙酯部位的萃取和破骨细胞的诱导，观察健骨颗粒乙酸乙酯萃取部位对破骨细胞Src-PI3K-Akt通路的影响，探讨其对破骨细胞功能的干预作用及作用机制。
方法：
1、健骨颗粒乙酸乙酯萃取部位的制备
首先将健骨颗粒药液(2.9g/ml生药)倒入分液漏斗中，其次加入1/3药液体积的乙酸乙酯有机试剂重复萃取4次，再次将健骨颗粒乙酸乙酯萃取部位依次经过旋转蒸发仪和水浴锅的蒸发制成浸膏，最后将浸膏放置于真空干燥箱中抽干，研钵碾磨成粉状，置于干燥缸中保存备用。
2、破骨细胞的诱导
取生长状态良好的RAW264.7细胞，按2.5×104/cm2的浓度接种于6孔细胞培养板，用RANKL(50ng/ml)诱导培养7d后得到破骨细胞。破骨细胞的鉴定：倒置相差显微镜观察培养的破骨细胞的形态、TRACP染色法检测酶活性。
3、细胞干预和实验分组
RAW264.7细胞根据不同的干预药物分为对照组（加入不含药物的50ng/mlRANKL完全培养基）、药物组[加入含健骨颗粒乙酸乙酯萃取部位(10ng/ml)的50ng/mlRANKL完全培养基]、抑制剂组[加入含Src蛋白抑制剂达沙替尼（0.8nM）的50ng/mlRANKL完全培养基]、混合组（加入同时含Src蛋白抑制剂达沙替尼和健骨颗粒乙酸乙酯萃取部位的50ng/mlRANKL完全培养基，药物剂量均同抑制剂组和药物组）。
4、指标检测
运用MTT法检测细胞增殖绘制增殖曲线，选择最佳干预药物浓度;采用Western Blot、Real time PCR检测c-Src、PI3K、Akt、NFATc1蛋白和基因的表达水平;TRACP染色对破骨细胞计数和甲苯胺蓝染色对骨吸收陷窝计数。
结果：
1、破骨细胞鉴定结果：RAW264.7细胞在RANKL因子(50ng/ml)刺激下诱导培养7d时获取大量的多核巨细胞，形态最佳，镜下可见核多达几十个，TRACP染色将细胞包浆染成紫红色，故符合鉴定标准。
2、最佳药物浓度选择：MTT检测发现3个时间点(24h、48h、72h)健骨颗粒乙酸乙酯萃取部位浓度（1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml）的增殖速度均高于同期对照组，当药物浓度为10ng/ml，细胞增殖作用最强(P＜0.01）。
3、破骨细胞和骨吸收陷窝计数结果显示：骨磨片行甲苯胺蓝染色光镜下可见大小不一，形状不规则的骨吸收陷窝。随着干预时间的推移，各组破骨细胞数和骨吸收陷窝数均有不同程度的增加。3个时间点(5d、6d、7d)，各用药组破骨细胞数和骨吸收陷窝数均低于同期对照组(P＜0.01），混合组降低幅度最大，抑制剂组次之，药物组最小。除药物组的骨吸收陷窝数和抑制剂组比较无差异(P＞0.05)，其余各用药物组差异均有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)
4、RT-qPCR和Western Blot结果显示：与对照组相比，各用药组的Src、PI3K、Akt、NFATc1mRNA和蛋白的表达均明显降低(P＜0.01或P＜0.05)，其中混合组降低幅度最大，抑制剂组次之，药物组最小。除药物组Src、PI3K、Akt、NFATc1蛋白及AktmRNA的表达与抑制剂组相比无差异(P＞0.05)，其余各用药组差异有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)。
结论：
1、RAW264.7细胞在50ng/mlRANKL因子刺激下培养7d获取的破骨细胞状态最佳，为开展后续实验奠定了基础。
2、健骨颗粒乙酸乙酯萃取部位对RAW264.7细胞在RANKL诱导下向破骨细胞的分化以及诱导后的破骨细胞骨吸收活性有明显的抑制作用;其抑制作用可能是通过降低破骨细胞SrcmRNA和蛋白的表达，进而下调其下游PI3K、Akt、NFATc1mRNA及蛋白表达来实现的。
通过对健骨颗粒乙酸乙酯部位的萃取和破骨细胞的诱导，观察健骨颗粒乙酸乙酯萃取部位对破骨细胞Src-PI3K-Akt通路的影响，探讨其对破骨细胞功能的干预作用及作用机制。
方法：
1、健骨颗粒乙酸乙酯萃取部位的制备
首先将健骨颗粒药液(2.9g/ml生药)倒入分液漏斗中，其次加入1/3药液体积的乙酸乙酯有机试剂重复萃取4次，再次将健骨颗粒乙酸乙酯萃取部位依次经过旋转蒸发仪和水浴锅的蒸发制成浸膏，最后将浸膏放置于真空干燥箱中抽干，研钵碾磨成粉状，置于干燥缸中保存备用。
2、破骨细胞的诱导
取生长状态良好的RAW264.7细胞，按2.5×104/cm2的浓度接种于6孔细胞培养板，用RANKL(50ng/ml)诱导培养7d后得到破骨细胞。破骨细胞的鉴定：倒置相差显微镜观察培养的破骨细胞的形态、TRACP染色法检测酶活性。
3、细胞干预和实验分组
RAW264.7细胞根据不同的干预药物分为对照组（加入不含药物的50ng/mlRANKL完全培养基）、药物组[加入含健骨颗粒乙酸乙酯萃取部位(10ng/ml)的50ng/mlRANKL完全培养基]、抑制剂组[加入含Src蛋白抑制剂达沙替尼（0.8nM）的50ng/mlRANKL完全培养基]、混合组（加入同时含Src蛋白抑制剂达沙替尼和健骨颗粒乙酸乙酯萃取部位的50ng/mlRANKL完全培养基，药物剂量均同抑制剂组和药物组）。
4、指标检测
运用MTT法检测细胞增殖绘制增殖曲线，选择最佳干预药物浓度;采用Western Blot、Real time PCR检测c-Src、PI3K、Akt、NFATc1蛋白和基因的表达水平;TRACP染色对破骨细胞计数和甲苯胺蓝染色对骨吸收陷窝计数。
结果：
1、破骨细胞鉴定结果：RAW264.7细胞在RANKL因子(50ng/ml)刺激下诱导培养7d时获取大量的多核巨细胞，形态最佳，镜下可见核多达几十个，TRACP染色将细胞包浆染成紫红色，故符合鉴定标准。
2、最佳药物浓度选择：MTT检测发现3个时间点(24h、48h、72h)健骨颗粒乙酸乙酯萃取部位浓度（1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml）的增殖速度均高于同期对照组，当药物浓度为10ng/ml，细胞增殖作用最强(P＜0.01）。
3、破骨细胞和骨吸收陷窝计数结果显示：骨磨片行甲苯胺蓝染色光镜下可见大小不一，形状不规则的骨吸收陷窝。随着干预时间的推移，各组破骨细胞数和骨吸收陷窝数均有不同程度的增加。3个时间点(5d、6d、7d)，各用药组破骨细胞数和骨吸收陷窝数均低于同期对照组(P＜0.01），混合组降低幅度最大，抑制剂组次之，药物组最小。除药物组的骨吸收陷窝数和抑制剂组比较无差异(P＞0.05)，其余各用药物组差异均有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)
4、RT-qPCR和Western Blot结果显示：与对照组相比，各用药组的Src、PI3K、Akt、NFATc1mRNA和蛋白的表达均明显降低(P＜0.01或P＜0.05)，其中混合组降低幅度最大，抑制剂组次之，药物组最小。除药物组Src、PI3K、Akt、NFATc1蛋白及AktmRNA的表达与抑制剂组相比无差异(P＞0.05)，其余各用药组差异有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)。
结论：
1、RAW264.7细胞在50ng/mlRANKL因子刺激下培养7d获取的破骨细胞状态最佳，为开展后续实验奠定了基础。
2、健骨颗粒乙酸乙酯萃取部位对RAW264.7细胞在RANKL诱导下向破骨细胞的分化以及诱导后的破骨细胞骨吸收活性有明显的抑制作用;其抑制作用可能是通过降低破骨细胞SrcmRNA和蛋白的表达，进而下调其下游PI3K、Akt、NFATc1mRNA及蛋白表达来实现的。