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目的探讨阿托伐醌抑制结直肠癌细胞增殖的分子机制,为开发阿托伐醌新药理作用奠定理论基础,并为结直肠癌的治疗提供新的研究策略。方法(1)使用噻唑蓝(MTT)法和细胞克隆形成实验,评价阿托伐醌对结直肠癌细胞增殖的影响。(2)使用Annexin V-FITC/PI双染色法和蛋白质免疫印迹方法,研究阿托伐醌对结直肠癌细胞凋亡的作用。(3)采用免疫印迹和免疫荧光方法,分析阿托伐醌对结直肠癌细胞自噬的作用。(4)通过二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针法,探究阿托伐醌处理结直肠癌细胞后胞内ROS的变化。(5)使用蛋白质免疫印迹方法,测定阿托伐醌处理后结直肠癌细胞内NOXs的表达变化,以及NOXs抑制剂GKT137831对阿托伐醌诱导的结直肠癌细胞自噬的影响。(6)建立BALB/c小鼠结直肠癌CT26细胞皮下移植瘤模型,动物水平上评价阿托伐醌对结直肠癌细胞的增殖抑制作用。结果(1)阿托伐醌抑制结直肠癌细胞增殖阿托伐醌处理结直肠癌SW480、HCT116细胞24 h后,细胞存活率下降,且呈药物浓度依赖性,其IC50值约为32μmol/L。但在低药物浓度下,细胞存活率已有明显下降,故本文选用4μmol/L和8μmol/L的阿托伐醌浓度进行后续细胞实验研究。采用4μmol/L和8μmol/L的阿托伐醌处理结直肠癌SW480、HCT116细胞后,相比对照组细胞克隆数明显减少。(2)阿托伐醌对结直肠癌细胞凋亡无明显影响阿托伐醌处理结直肠癌SW480、HCT116细胞后,Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡率无明显变化。此外,蛋白质免疫印迹检测到阿托伐醌处理后结直肠癌SW480、HCT116细胞中Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase3的表达无明显变化。(3)阿托伐醌促进结直肠癌细胞自噬阿托伐醌处理结直肠癌SW480、HCT116细胞后,自噬标志蛋白LC3的活化增加,Beclin-1的表达增加,p62的表达减少。加入自噬抑制剂氯奎(CQ)与阿托伐醌共处理发现,相比阿托伐醌单独处理,LC3的活化进一步增加。此外,免疫荧光实验结果与蛋白质免疫印迹实验一致。(4)阿托伐醌通过抑制Akt/mTOR信号通路促进结直肠癌细胞自噬阿托伐醌处理结直肠癌SW480、HCT116细胞后,p-Akt、p-mTOR的表达量减少,而Akt、mTOR的表达无明显变化,说明阿托伐醌能通过抑制Akt/mTOR信号通路促进结直肠癌细胞自噬。(5)阿托伐醌通过促进自噬进而抑制结直肠癌细胞增殖在siRNA干扰下,阿托伐醌处理结直肠癌SW480、HCT116细胞24 h,siAtg5沉默组的细胞存活率高于siNC组。另外,自噬抑制剂3-MA与阿托伐醌共处理结直肠癌SW480、HCT116细胞,其细胞克隆数与阿托伐醌单独处理相比明显增加。以上结果表明阿托伐醌能通过促进自噬进而抑制结直肠癌细胞增殖。(6)阿托伐醌通过诱发ROS产生激活结直肠癌细胞自噬阿托伐醌处理结直肠癌SW480、HCT116细胞后,胞内ROS水平增加。加入ROS清除剂NAC可降低阿托伐醌介导的ROS增加。并且,NAC与阿托伐醌与共处理结直肠癌细胞后,相比阿托伐醌单独处理,p-Akt、p-mTOR、p62的表达增加,LC3的活化减少,Beclin-1的表达减少,证明阿托伐醌通过诱发ROS产生,进而促进结直肠癌细胞自噬。(7)阿托伐醌通过上调NOX2的表达进而诱导结直肠癌细胞自噬阿托伐醌处理结直肠癌SW480、HCT116细胞后,胞内NOX2的表达上调。同时加入NOXs抑制剂GKT137831进行干预,可抑制阿托伐醌诱导ROS的增加和结直肠癌细胞自噬。(8)阿托伐醌抑制小鼠结直肠癌皮下移植瘤的生长建立BALB/c小鼠结直肠癌CT26细胞皮下移植瘤模型,经阿托伐醌灌胃处理,四周后处死小鼠,取肿瘤组织进行观察,阿托伐醌治疗组的肿瘤组织的体积和重量都明显小于对照组。结论阿托伐醌通过上调NOX2的表达激发胞内ROS产生,进而通过抑制Akt/mTOR信号途径诱导结直肠癌细胞自噬,从而抑制结直肠癌细胞增殖。