研究背景和目的：人体免疫系统是一个非常复杂的装置，它不仅保护身体免受微生物等外部侵害，而且还保护自身受损或功能失常的组织，其中第一道保护屏障之一是炎症。炎症是先天免疫的主要机制，并在许多过程中受到调节。这种调节步骤之一是细胞因子网络，其中肿瘤坏死因子α(TNF-α)是复杂细胞因子网络的核心角色，发挥着关键的作用。TNF-α生物活性的改变参与调控自身免疫和癌症等多种疾病的发展进程，调节细胞的生长、分化、死亡等。G蛋白是膜内能与鸟苷二磷酸结合，具有GTP水解酶活性的一类信号传导蛋白，在细胞内信号传导途径中发挥重要的作用。近年来研究发现Gαi蛋白通过激活相关信号通路参与介导多种炎症的发生发展，提示Gαi蛋白可能是炎症调控的潜在靶点。在本论文中拟在MEFs细胞中探究Gαi蛋白参与介导TNF-α信号转导的相关分子机制，并且通过THP-1和BMDM细胞模型进一步明确Gαi1/3在炎症中的作用，为某些疾病的炎症反应治疗寻找新的靶点。
　　研究方法：通过培养WT，Gαi1/3DKO，Oail KO，Gαi3Ko，Gαi2KO的MEFs细胞以及Gab1KO的MEFs细胞，培育并在MEFs利用shRNA质粒载体靶向敲减Gαi1和/或Gαi3建立稳转细胞株;再转染CRISPR/Case9-KO病毒敲除Gαi1和Gαi3;再在此细胞株中借助于脂质体转染导入外源性Gαi1和Gαi3，获得OE-Gαi1/3MEFs稳转细胞株;在DKO MEFs中通过脂质体转染重新导入外源性Gαi1和Gαi3，创建不同表达的稳转细胞株，获得Ad-Gαi1MEFs和Ad-Gαi3MEFs。对上述细胞株施用TNF-α处理，采用Western blotting(WB)法检测细胞内相关蛋白表达量(Akt-mTORCl、MAPK和NF-κB信号通路)以及下游接头蛋白Gab1的表达情况;运用shRNA干扰法在人单核巨噬细胞(THP-1)中靶向敲减Gαi1和Gαi3，检测Gαi1/3-shRNA THP-1细胞中炎症因子的表达;运用shRNA干扰法在小鼠原代骨髓巨噬细胞(BMDM)中靶向敲减Gαi1和Gαi3，检测Gαi1/3-shRNA BMDM细胞中炎症因子的表达和Akt-mTORCl、MAPK信号通路的活化水平。
　　研究结果：通过WB检测发现，在MEFs中，Gαi1/3双敲(DKO)阻断了TNF-α诱导的AKT-mTOR和MAPK信号通路的活化;此外，在TNF-α处理下，Gαi1/3-shRNA、Gαi1-KO、Gαi3-KO MEFs下游信号水平均显著降低，而Gαi2-KO MEFs中无明显变化。同时，TNF-α处理后，Gαi1/3-DKO MEFs中重新表达Gαi1(Ad-Gαi1)和Gai3(Ad-Gαi3)部分拯救了TNF-α的下游信号转导，并且OE-Gαi1/3MEFs中TNF-α下游信号活化显著增强。此外，Gab1KO MEFs在药物处理后Akt-mTORC1和MAPK通路相关蛋白活化水平显著下降。进一步研究表明，在人单核巨噬细胞THP-1中，Gαi1/3敲减显著降低了炎症因子的表达;并且在小鼠原代骨髓巨噬细胞中，shRNA敲减Gαi1/3降低了Akt-mTORCl/MAPK信号通路的活化和炎症因子的表达。
　　研究结论：上述研究结果表明Gαi1/3参与介导TNF-α诱导的下游Akt-mTOR/MAPK信号转导。同时，Gαi1/3参与调控TNF-α诱导的巨噬细胞的炎症反应。本研究丰富了对TNF-α介导的炎症反应活性调控及机制的新认识，由于TNF-α在炎症中发挥重要作用，Gαi1/3可能成为炎症反应临床诊断和治疗的新型靶点。