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支气管哮喘(简称哮喘)是一种危害人类健康的常见的慢性气道炎症性疾病。目前认为哮喘是由气道的炎性细胞与结构细胞等多种细胞包括和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病,并伴随气道的高反应性。气道慢性炎症是哮喘的本质,随着研究的进展,人们认识到哮喘的气道炎症存在不同的亚型,可分为嗜酸细胞性哮喘(eosinophilic asthma, EA)和非嗜酸细胞性哮喘(non-eosinophilic asthma, NEA),我们课题组前期研究证实其中中性粒细胞性哮喘(neutrophilic asthma, NA)占非嗜酸细胞性哮喘半数以上。哮喘发病机制复杂,至今尚未完全清楚。较多研究表明,CD4+T淋巴细胞调控支气管哮喘气道炎症中起着关键作用。Thl/Th2细胞比例和功能的失衡即Th2优势化,被证实是过敏性哮喘的标志。但研究发现非特应性哮喘患者可表现为非Th2型气道炎症。因此,该理论不能完全解释哮喘全部的临床及病理生理改变。为了进一步探讨中性粒细胞哮喘的发病机制,本课题组已成功建立了中性粒细胞哮喘小鼠模型,动物实验研究结果显示Th17细胞通过IL-17介导哮喘小鼠中性粒细胞性气道炎症的发生,NA小鼠存在强烈的Th17细胞免疫。并且用流式细胞术检测发现NA小鼠脾脏Th17细胞Ki-67蛋白表达增高,提示NA小鼠Thl7细胞维持持续存活的状态。Th17细胞持续存活是导致NA小鼠Th17细胞优势的一个重要机制。目前尚无NA小鼠Th17细胞持续存活的机制研究,有待进一步深入研究,为治疗NA提供新的靶点。这是本课题所要研究的第一个问题。目前主要使用吸入糖皮质激素治疗哮喘。糖皮质激素具有抗炎作用,能够有效控制大部分轻度和中度哮喘患者的病情,然而有小部分病人对糖皮质激素反应不佳。研究发现,这部分患者其中大多数是中性粒细胞性哮喘,需要较大剂量的激素才能控制症状。糖皮质激素有一定的局限性,如果全身较大剂量的应用会引起一定的毒副作用。研究人员曾尝试许多新的治疗方法,但是到目前为止均未成功运用到临床。我们前期实验证实Th17细胞在NA小鼠发病中起着重要的作用。针对Th17细胞的靶向治疗也成为目前研究的热点。JAK/STAT信号通路参与调控Th17细胞分化,存活和增殖。那么,抑制JAK/STAT信号通路是否能影响NA小鼠的中性粒细胞气道炎症?本课题研究第二部分采用了JAK/STAT信号通路抑制剂AG490干预Th17细胞介导的中性粒细胞哮喘小鼠,了解其对中性粒细胞气道炎症的影响及进行相关机制的探讨,为NA的治疗寻求新线索及提供理论依据。研究分为两部分进行：第一部分JAK/STAT5信号通路在Thl7细胞介导的中性粒细胞性哮喘小鼠模型中的作用目的探讨JAK/STAT5信号通路参与调控Th17细胞存活及凋亡的相关机制方法NA组小鼠于第0、6、13天予100μg卵蛋白(OVA)、0.1μg脂多糖(LPS)经气道滴入致敏。于第21天起连续14天雾化吸入1%OVA激发,每次60min,连续雾化3天。NC组不做任何处理。处死小鼠后,用磁珠纯化的小鼠脾源性CD4+T,在外源性IL-7以及STAT5抑制剂的作用下,采用流式细胞术检测已分化的Th17细胞占CD4+T细胞的比例以及Thl7细胞上Ki-67、Bcl-2、p-STAT5以及活化型Caspase3表达。结果在体外,在IL-7作用后NA小鼠Th17细胞上Ki-67和Bcl-2比例高于空白对照组(均P<0.05),加入STAT5抑制剂处理后明显下调NA小鼠Th17细胞上ki-67和Bcl-2表达(均P<0.05)；在IL-7作用后NA小鼠Th17细胞上活化型Caspase3蛋白表达低于空白对照组(P<0.05),加入STAT5抑制剂处理后明显下调NA小鼠Th17细胞上活化型Caspase3蛋白表达(P<0.05)。IL-7诱导NA小鼠Th17细胞STAT5磷酸化水平高于对照组(P<0.05)；IL-7对NC组小鼠Th17细胞上Ki-67以及活化型Caspase3表达无明显影响(均P>0.05)。结论1 IL-7可维持NA小鼠Th17细胞的存活；2 JAK/STAT5信号通路激活参与调控NA小鼠的Th17细胞存活及凋亡,JAK/STAT5信号通路可能成为治疗的NA的潜在靶点。第二部分AG490对中性粒细胞哮喘小鼠模型气道炎症的影响目的观察苯亚甲基丙二睛脂类衍生物AG490对中性粒细胞性哮喘模型小鼠气道炎症的影响。方法无特定病原体(SPF)级C57BL雌性小鼠54只,按随机数字表法分成中性粒细胞性哮喘(NA)组、AG490处理的NA组(NAA)组和正常(NC)组,每组18只。NA、NAA组小鼠于第0、6、13天经气道滴入100μg卵蛋白(OVA))、0.1μg脂多糖(LPS)致敏。NAA组小鼠于实验第21天起经腹腔注射AG490,每只500μg,隔天一次,共4次。于第21天起连续7d雾化吸入1%OVA激发,每次1 h。最后1次雾化结束后第24 h,收集小鼠标本并检测相关指标。收集支气管肺泡灌洗液(BALF)并检测其有核细胞总数及分类比例；分离肺组织行HE染色,光镜下观察肺组织病理变化；流式细胞术检测肺部Th17细胞比例。NA小鼠成模后用免疫磁珠纯化的小鼠脾源性CD4+T,在IL-7以及AG490作用后,采用流式细胞术检测已分化的Th17细胞占CD4+T细胞的比例以及Th17细胞上Ki-67、Bcl-2以及活化型Caspase3表达。结果与NA组相比,NAA组BALF有核细胞计数、中性粒细胞百分比、嗜酸性粒细胞百分比均明显降低(均P<0.05), NAA组肺组织病理学改变较NA组明显减轻。与NA组相比,NAA组BALF IL-17A水平降低、肺组织Th17细胞比例减少(均P<0.05)。在体外实验,与对照组相比,AG490组Th17细胞上ki-67、Bcl-2蛋白百分比减少,Th17细胞上Caspase3百分比增多(均P<0.05)。结论AG490可能通过调控抗凋亡蛋白Bcl-2及Caspase3,成为潜在治疗NA的新方法。