论文部分内容阅读
背景:幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是人体最常见的病原微生物之一,其感染可导致胃炎、消化性溃疡和胃癌等多种胃肠疾病。研究表明,临床上至少75%的胃癌与H.pylori感染密切相关。因此,H.pylori已被世界卫生组织列为I类致癌因子。幽门螺杆菌感染过程中可分泌多种毒力因子,如,脲酶(urease,Ure)、细胞毒素相关基因A(cytotoxin-associated gene A,Cag A)和空泡细胞毒素A(vacuolating cytotoxin A,VacA)等,在诱发宿主细胞发生病变的过程中扮演着举足轻重的角色。研究证实,H.pylori感染可致胃黏膜上皮细胞线粒体功能障碍、凋亡和自噬,VacA在其中发挥着不可或缺的关键作用。然而,VacA作用的分子机制以及对H.pylori感染致病活性的影响在很大程度上是未知的,或知之甚少。阐明H.pylori感染致病中其毒力因子作用的分子机制,对于H.pylori感染相关胃肠疾病特别是胃癌的防治具有重要意义。目的:探讨幽门螺杆菌感染致胃黏膜上皮细胞损伤的自噬机制,阐明幽门螺杆菌感染过程中VacA诱发细胞线粒体自噬的分子机制。方法:1)改良液体培养方法以利于大规模培养幽门螺杆菌,建立能够延长幽门螺杆菌与宿主细胞相互作用时间的细菌-细胞共培养体系。2)利用生物信息学分析幽门螺杆菌与胃黏膜细胞共培养(相互作用)的数据集,找寻和筛选可能参与幽门螺杆菌致病过程的差异基因或信号通路;建立H.pylori感染胃黏膜上皮GES-1细胞的共培养模型,采用流式细胞术、划痕实验、Transwell小室实验、Western blot检测H.pylori感染后GES-1细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭、自噬和干性改变。3)采用基因重组技术体外诱导表达重组VacA,即VacA的成熟和活性形式(p88),中性红染色检测空泡毒素活性。应用流式细胞术、Ed U标记、免疫荧光技术和Western blot检测p88作用后GES-1细胞增殖、凋亡、线粒体膜电位和线粒体自噬。4)采用银染、质谱、免疫荧光、蛋白酶K保护、Co-IP、GST/His-Pulldown、和Western blot等方法检测与p88相互作用的蛋白质和线粒体相关(膜)蛋白;蛋白质-蛋白质对接方法(ZDOCK)确定可能的相互作用位点。结果:1)改良后的幽门螺杆菌液体培养方体系较适合于H.pylori的生长和增殖,可在体外较大规模地培养H.pylori,应用于体内外实验研究。同时发现适量的镍对H.pylori的增殖有一定的促进作用,但较高浓度则显示为毒性效应。建立的幽门螺杆菌-胃黏膜上皮细胞共培养体系创建了较适宜于细菌和细胞共同生长的培养环境,在一定程度上延长了细菌与细胞的相互作用时间。与传统共培养模式比较,H.pylori的存活时间有不足24 h延长至96 h,被感染的细胞呈现明显的空泡变性。2)生物信息学分析的结果表明,H.pylori感染引发胃黏膜上皮细胞增殖-凋亡通路、代谢通路、P53通路和自噬调控通路等多个生物学途径的改变。H.pylori与胃黏膜上皮细胞共培养,短期(1代)作用的差异基因重点富集在细胞质和线粒体,主要影响细胞蛋白质呈递和氨基酸生物合成;而长期(30代)作用差异基因主要集中在细胞膜和蛋白质及其结合,影响细胞核质转运、细胞周期和线粒体自噬等过程。建立H.pylori与GES-1细胞共培养体系进行验证,实验结果证实,H.pylori感染可抑制GES-1细胞的增殖并诱导其凋亡。同时,H.pylori感染可显著促进GES-1细胞发生自噬,进一步研究提示H.pylori诱发的自噬可能为线粒体自噬。H.pylori培养上清液(HPCF)具有类似的效应。H.pylori长期慢性感染则诱导GES-1细胞的增殖能力有所提高,细胞自噬水平、细胞迁徙能力和侵袭能力明显增强,细胞干性和体外成球能力显著增强。3)体外诱导表达的VacA(p88)具有生物学活性,能够诱导细胞空泡明显变性。p88处理后GES-1细胞的增殖能力降低、细胞凋亡显著增加,GES-1细胞及He La YFP-Parkin细胞线粒体膜电位和线粒体DNA含量降低、发生PINK1/Parkin通路依赖的线粒体自噬。分析p88诱导宿主细胞线粒体自噬的分子机制,多种途径证实VacA(p88)与细胞线粒体相关(膜)蛋白Tom20、Tom40、Tom70、STOM和PGAM5相互结合。上述结果提示H.pylori感染胃黏膜上皮细胞过程中其分泌的VacA靶向进入细胞线粒体,通过与线粒体膜蛋白的相互作用导入线粒体内膜形成阴离子通道,从而降低线粒体内膜电位而致线粒体功能障碍,并促进PINK1积累和Parkin向线粒体募集而诱导线粒体自噬,最终导致细胞损伤或死亡。结论:幽门螺杆菌感染诱导胃黏膜上皮细胞凋亡和自噬、增强细胞的迁移侵袭能力和干性。幽门螺杆菌毒力因子VacA作为主要介质直接靶向线粒体,通过与线粒体蛋白的相互作用而致线粒体功能障碍,诱发PINK1/Parkin通路依赖的线粒体自噬,进而导致宿主细胞的损伤或死亡。