目前植物RNAi载体的构建常用的是Gateway的克隆方法，通过BP克隆和LR克隆，就可以将正义反义链插入目标载体。步骤简单，可是BP克隆酶和LR克隆酶十分昂贵，而且反应耗时长，这阻碍了很多实验室大规模研究植物功能基因组。 本研究旨在探索一种经济、快速、高效的植物RNAi载体构建方法。实验以质粒pAGRIKOIA 为基本材料，利用四个。Nb．BbvC Ⅰ切刻酶位点组合或λ-外切酶的5’-3’的外切酶活性，处理片断产生3’端突出多个碱基，载体和片断混合后利用片断间的定向匹配，形成重组质粒。具体是以质粒pAGRIKOIA为模板，根据载体骨架序列设计引物，引物的两端各带有两个Nb．BbvC Ⅰ切刻酶位点，扩增后产物与T载体连接，构成中间质粒pT-ARI。根据pAGRIKOIA的双向内含子序列设计引物，引物的两端各带有两个Nb．BbVC Ⅰ切刻酶位点，扩增后产物和pBluescript Ⅱ SKl(+)载体连接，构成中间质粒SK-intron。以报告基因GUS作为沉默的靶序列，根据GUS序列，取其中约500bp作为插入载体的正义片断和反义片断，分别设计正义片断和反义片断的硫代引物，即引物的第17个碱基硫代磷酸化。引物扩增前用T4 Polynucleotide Kinase(T4 PNK)处理30 min，扩增后产物分别用λ-外切酶处理几分钟后即可回收，片段产生3’端突出的粘性末端。质粒pT-ARI和SE-intron分别用Nb．BbvC Ⅰ切刻酶处理后也产生3’端突出末端，回收含载体骨架的片断和内含子片断，载体骨架片断再进行去磷酸化处理。将上述处理过的载体骨架片断、内含子片断、正义片断和反义片断以一定的比例混合，冰浴几分钟后用常规法转化大肠杆菌，涂布含卡那霉素的LB平板，就可以筛选重组子，将获得的重组子命名为pARIKOIA-GUSi。该载体通过农杆菌介导转化稳定表达GUS基因的拟南芥，通过GUS染色发现转入沉默载体后的GUS基因表达下调或沉默。说明该载体的构建方法是有效的。 本RNAi载体构建方法的特点是载体骨架和内含子片段以中间载体存在，酶切后就可使用，避免片段的突变；正义链、反义链仅需PCR后λ-外切酶处理几分钟就可以回收，四个片段混合，无需连接酶，冰浴几分钟转化就可获得重组子。优点是突变少、成本低、简单、快速，应该是一种值得推广的构建植物RNAi载体的好方法。