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1目的通过观察脾肾亏虚证复发性流产患者及正常妊娠患者外周血Tim-3、Gal-9的表达情况,从免疫调控角度探讨复发性流产患者外周血相关蛋白表达与复发性流产的关系;通过检测正常妊娠小鼠以及复发性流产小鼠蜕膜组织Tim-3、Gal-9蛋白表达、脾脏组织淋巴细胞增殖情况,探讨补肾安胎冲剂通过调控Tim-3-Gal-9通路干预复发性流产小鼠的机制,为临床补肾健脾中药治疗复发性流产提供进一步的实验依据。2方法搜集2019年01月01日至2019年12月31日在安徽省中医院妇科、生殖中心门诊及入院治疗的20例复发性流产患者设为实验组;同一段时期孕检的正常早期20例妊娠患者设为对照组。运用实时免疫荧光(Real-time PCR)法和蛋白质免疫印迹(Western blot)法分别测定两组患者外周血Tim-3、Gal-9的mRNA和蛋白表达,并对检测数据进行统计学分析。取40只CBA/J雌性小鼠,15只DBA/2雄性小鼠,5只BALB/c雄性小鼠,适应性饲养1周后,每晚按2:1比例合笼交配,雌性CBA/J小鼠×雄性DBA/2小鼠合笼建立复发性流产(RSA)模型;雌性CBA/J小鼠×雄性BALB/c小鼠合笼建立正常妊娠模型;以雌性小鼠检出阴栓者或阴道内见精子者视为妊娠第0天。妊娠后随机分为四组,每组10只小鼠,分别为正常妊娠组、复发性流产模型组、中药高、低剂量组。妊娠的第1天开始灌胃干预,正常妊娠组、复发性流产模型组予以等量蒸馏水灌胃;中药低、高剂量组分别以补肾安胎冲剂蒸馏水稀释后灌胃(剂量分别按照11.7g/kg.d、23.4g/kg.d),各组均连续15天,末次给药24h后,称重,摘眼球采血,处死小鼠,摘取子宫蜕膜,计算器官重量指数,剖视子宫观察各组小鼠子宫及胚胎发育情况,计算流产率、胚胎丢失率,用MTT法检测小鼠脾脏组织上淋巴细胞的增殖情况,分别用Real-time PCR、Western blot检测小鼠蜕膜组织中Tim-3、Gal-9的的mRNA和蛋白表达情况。3结果3.1临床研究结果3.1.1一般情况比较与对照组比较,实验组在年龄、孕周无显著性差异(P>0.05)。3.1.2 Real-time PCR 法和 Western blot 法检测结果分析Real-time PCR法与Western blot法检测结果分析:Tim-3在两组外周血淋巴细胞中均有表达,与对照组比较,实验组Tim-3的mRNA和蛋白表达高于对照组,有显著性差异(P<0.01);Gal-9在两组外周血淋巴细胞中均有表达,与对照组比较,实验组中Gal-9的mRNA和蛋白表达低于对照组,有显著性差异(P<0.01)。3.2 实验研究结果3.2.1各组孕鼠子宫及胚胎发育情况正常妊娠组孕鼠子宫形态可见规律的凹凸形状,胚胎呈串珠样隆起,外观颜色呈淡红色,宫腔未见瘀血及出血点;复发性流产模型组外观子宫颜色呈黯红色,子宫串珠样胚胎隆起不明显,可见明显瘀血点;补肾安胎冲剂低剂量组孕鼠子宫颜色淡黯,子宫及胚胎体积欠均匀,宫腔内可见少量瘀血点;补肾安胎冲剂高剂量组孕鼠子宫呈颜色淡红色,如串珠样隆起,胚胎发育良好,宫腔出血点不明显。3.2.2各组妊娠小鼠流产率、胚胎丢失率与正常妊娠组比较,模型组RSA小鼠流产率、胚胎丢失率显著升高(P<0.01)。与模型组比较,补肾安胎冲剂低剂量组流产率、胚胎丢失率低于模型组,有显著性差异(P<0.05);补肾安胎冲剂高剂量组RSA小鼠流产率、胚胎丢失率降低显著,有显著性差异(P<0.01);而补肾安胎冲剂高、低剂量组流产率、胚胎丢失率有显著性差异(P<0.01)。3.2.3各组妊娠小鼠脾脏淋巴细胞增殖情况与正常妊娠组比较,模型组RSA小鼠脾脏淋巴细胞增殖显著降低,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,补肾安胎冲剂高剂量组小鼠脾脏淋巴细胞增殖升高显著,差异有显著统计学意义(P<0.01),中药低剂量组淋巴细胞数量升高,差异有统计学意义(P<0.05);而补肾安胎冲剂低剂量组与高剂量组相比差异有统计学意义(P<0.05)。3.2.4各组妊娠小鼠蜕膜组织Tim-3、Gal-9mRNA和蛋白表达和正常妊娠组比较,模型组小鼠蜕膜Tim-3mRNA和蛋白表达含量显著升高(P<0.01);与模型组相比,中药高剂量组Tim-3蛋白表达含量显著降低(P<0.01),中药低剂量组Tim-3蛋白表达含量无统计学意义(P>0.05);与中药高剂量组相比,中药低剂量组表达量升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。和正常妊娠组比较,模型组小鼠蜕膜组织Gal-9mRNA和蛋白表达含量显著降低(P<0.01);与模型组相比,中药高剂量组Gal-9蛋白表达含量显著升高(P<0.01),中药低剂量组Gal-9蛋白表达含量无统计学意义(P>0.05);与中药高剂量组相比,中药低剂量组表达量降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。4结论4.1复发性流产患者外周血淋巴细胞Tim-3、Gal-9mRNA和蛋白表达异常。4.2复发性流产患者外周血淋巴细胞Tim-3mRNA和蛋白表达明显高于正常早期妊娠患者,Gal-9mRNA和蛋白表达明显低于正常早期妊娠患者,提示外周血Tim-3、Gal-9mRNA和蛋白表达异常与复发性流产发病存在相关性。4.3补肾安胎冲剂可改善RSA小鼠的妊娠子宫、胚胎发育。4.4补肾安胎冲剂可降低RSA小鼠的流产率、胚胎丢失率。4.5改善母胎界面免疫耐受,促进妊娠小鼠脾脏淋巴细胞的增殖可能是补肾安胎冲剂防治流产的免疫调控机制之一。(1)补肾安胎冲剂通过降低Tim-3的蛋白表达水平,使其与配体Gal-9结合后抑制Thl细胞功能,来实现RSA小鼠母胎界面免疫平衡以Th2占优势,降低流产风险,维持妊娠。(2)补肾安胎冲剂可能通过提高脾脏组织淋巴细胞增殖水平,改善免疫耐受,维持妊娠。